[发明专利]两种δ-芋螺毒素多肽及制备方法

说明书

本发明公开了两种δ‑芋螺毒素多肽及制备方法，属于生物化学和分子生物学领域。所述多肽的氨基酸序列为全新的序列，采用花玛瑙芋螺毒腺管分离纯化方法制备所述的两种多肽。该两种δ‑芋螺毒素多肽经动物水平的热板法和烫尾法实验后，证明都具有较强的镇痛活性。本发明的两种δ‑芋螺毒素多肽，经动物水平的热板法和烫尾法实验后，证明其具有较强的镇痛活性，可作为在镇痛药物中的应用。

技术领域

本发明涉及两种δ-芋螺毒素多肽及制备方法，属于生物化学和分子生物学领域。

技术背景

芋螺毒素是一类芋螺分泌的、用于麻醉猎物的神经毒素肽，由于其结构新颖，活性强，选择性高，能区分各种离子通道的不同亚型，为离子通道的研究开辟新的思路。芋螺毒素的生物活性强，能特异性地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道。尤其是对电压门控或配体门控离子通道具有较高的选择性。芋螺毒素现已被广泛应用于神经药理学中，在镇痛、戒烟、戒毒，以及治疗帕金森症等神经退行性疾病、精神病等重大疾病方面具有极好的应用前景。芋螺毒素作为具有特异活性和高选择性的天然产物，具有开发成有价值的药物或者药物先导化合物的潜能。芋螺毒素在缓解疼痛方面具有较强的药效。花玛瑙芋螺(Conus achates)是毒性强的食鱼和食软体动物的芋螺之一。其以鱼和软体动物为食，其毒液毒性非常强，能在瞬间使猎物麻痹甚至死亡。与其他种类芋螺毒素相比，花玛瑙芋螺毒素有其显著的结构特点，如较强的疏水性，较多的负电荷，已引起学者的广泛兴趣，并探究其生物活性。通过NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中BLAST功能对花玛瑙芋螺毒素SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行同源性比对。检索发现与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2相似度约为60％的PVIA，经研究发现其对Nav1.2的IC₅₀值为2.9μM，对Nav1.4的IC₅₀值为5.2μM，对Nav1.7的IC₅₀值为1.9μM。通过文献调研还发现，与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2相似度约为70％的NgVIA，不但具有影响钠电流失活的作用，且选择100pmol/g剂量进行小鼠颅内注射，则10min后小鼠死亡。提示了SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可能具有较强的生物活性。本说明书中通过开展动物体内研究，确定了SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的镇痛活性。

发明内容

本发明是为了解决δ-芋螺毒素多肽的制备及其在制备镇痛药物中应用的问题，提供两种δ-芋螺毒素多肽及制备方法。

本发明解决上述应用的问题采用的技术方案：两种δ-芋螺毒素多肽序列为：

SEQ ID NO.1：DECYSOGTFCGIKOGLCCSARCFSFVCISLEF；

SEQ ID NO.2：DECFSOGTFCGIKOGLCCSAWCYSFFCLTLNF；

O为羟脯氨酸，其中N末端的第一个半胱氨酸与第四个胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第五个胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第六个胱氨酸形成二硫键。

本发明所述两种δ-芋螺毒素多肽的制备方法步骤如下：

(1)将花玛瑙芋螺解剖出的毒液管剪成1～3mm长的小段，加入乙腈，超声匀浆2～5min，随后离心，取上清液；在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后备用；

(2)将冷冻干燥后的样品溶于乙腈中，采用C18柱经体积百分比30％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为254～280nm，收集41～43min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后备用；

(3)将41～43min接收的馏分溶于乙腈中，采用C18柱经体积百分比35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为254～280nm，收集31.5～32min出现的吸收峰，此馏分即为SEQ ID NO.1，收集32～32.5min出现的吸收峰，此馏分即为SEQ ID NO.2。