[发明专利]一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪

说明书

本发明属于细胞生物学检测领域，具体而言涉及一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法及分离仪。方法包括：（1）CD71阳性细胞系（K562）培养及抗体结合力、特异性检测；（2）利用CTCBIOPSY®检测系统及K562细胞建立捕获体系并利用脐带血优化捕获条件；（3）分离收集胎儿有核红细胞：利用偶联CD71多克隆抗体的微球扩大目的细胞直径，借助CTCBIOPSY®检测系统，利用过滤原理分离孕妇外周血中的有核红细胞。该方法捕获效率高、成本低、操作步骤简单、耗时短、灵敏度高。

技术领域

本发明属于细胞生物学检测领域，具体而言涉及一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法及分离仪。

背景技术

出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢等方面异常的一种统称,通常包括先天结构畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病以及功能异常如盲、聋和智力障碍等。2012年9月,原国家卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告》中指出，目前中国出生缺陷发生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷数约90万例，其中出生时临床明显可见的出生缺陷约有25万例。出生缺陷是导致早期流产、早产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡主要原因，可导致儿童长期患病、寿命缩短、甚至终身残疾。出生缺陷不但严重危害儿童生存和生活质量，给家庭、社会带来巨大的经济负担，已成为影响人口素质和群体健康水平的公共卫生问题。因此产前筛查、产前诊断对预防出生缺陷至关重要。

产前诊断是指结合遗传学检测和影像检查结果，对出生前的胎儿是否患有某些遗传病或先天畸形做出诊断，可通过产前诊断技术检测出染色体数目异常疾病、基因拷贝数变异疾病、单基因疾病等出生缺陷。目前，产前诊断按取样方法的不同分为有创性产前诊断和无创性产前诊断。其中，有创性产前诊断方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛膜穿刺、脐血取样，虽然结果准确度较高，但这些侵入性手段对母体和胎儿均有一定的风险，可能导致阴道出血，羊水泄露、胎膜破裂、感染或胎儿流产等并发症。

自从母体外周血中发现胎儿游离DNA、RNA及胎儿细胞为无创产前诊断提供了可能。自1997年母体血浆中源自胎儿的游离DNA片段被发现以来，母体外周血中游离的胎儿DNA一直作为无创性产前诊断的重点研究材料，并于2008年，利用新一代高通量测序技术实现了对利用游离胎儿DNA做出胎儿患有21-三体综合征的诊断。此后，基于孕妇外周血游离胎儿DNA的无创性产前检测技术得到了大规模的科研及临床验证，技术得到迅猛发展。但是利用胎儿游离DNA有其自身的缺陷，表现在：（1）母血中除了胎儿来源的游离DNA，还有存在大量母源DNA，源自胎儿的DNA含量占总量约3-20%，且个体差异较大；（2）胎儿基因组的其中一半是来源于母亲，因此DNA的来源在目前来说比较难以区分；（3）母血中胎儿游离DNA是片段化的，不能覆盖胎儿完整的基因组，所以目前主要是针对于染色体数目异常的检测。因此孕妇外周血中游离DNA无法检测染色体微缺失、微重复、单基因病检测等要求和内容更为精细的项目。

基于以上原因，研究者们将研究重点转移到到母体外周血中寻找另一种源自胎儿的遗传成分——胎儿细胞。与外周血中游离DNA不同，胎儿细胞含有完整的细胞核，携带了全部的胎儿基因组信息。从孕妇外周血中分离的胎儿细胞，用于全基因组测序，不仅可以检测胎儿染色体的非整倍性，染色体的缺失和插入，对于单个位点的SNP造成的单基因疾病等都能有效检测，因此孕妇外周血中的胎儿细胞是进行无创产前诊断的最佳取材。目前发现可以通过胎盘进入母体外周血的胎儿细胞有：滋养层细胞、淋巴细胞、胎儿有核红细胞。

胎儿有核红细胞拥有完整的遗传信息，在孕早期，胎儿有核红细胞在孕妇外周血液中含量丰富，且细胞生存周期短，在婴儿分娩几天后基本消失；有明显的形态学特征，具有一些细胞表面标记（如CD71、GPA、CD147）和一些胞内标记如胚胎或胎儿（γ-）血红蛋白，可以通过一些阳性抗体如CD71、GPA、胎儿血红蛋白等进行富集和识别。因此相对于其他循环于母血中的胎儿细胞，有核红细胞一直以来被认为是产前诊断的首选靶细胞，但其在母血循环中数量极少，影响其应用于产前诊断。