[发明专利]一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 202010236325.5 | 申请日： | 2020-03-30 |
| 公开（公告）号： | CN111254225A | 公开（公告）日： | 2020-06-09 |
| 发明（设计）人： | 梁红茹;黄瑜聪;李宁求;林强;付小哲;刘礼辉;牛银杰;黄志斌 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 颜希文 |
| 地址： | 510170 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 鳜鱼 病毒 弹状病毒 双重 pcr 检测 试剂盒 方法 | ||
1.一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物、EasyTaqPCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；
其中，所述引物包括针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物为SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；所述针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物为SCRV-280-F/SCRV-280-R；其中，所述引物序列如下所示：
SCRIV-400-F：AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGC；SEQ ID NO：1；
SCRIV-400-R：CCATGTCCCTGACTGAGCTGCTC；SEQ ID NO：2；
SCRV-280-F：GTGGCAGCAATTGACATGTTCTTC；SEQ ID NO：3；
SCRV-280-R：GATACTTTGGACAATCCCATGTC；SEQ ID NO：4。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EasyTaq PCR SuperMix为2×EasyTaqPCR SuperMix，所述阴性对照液为无菌ddH2O，所述阳性对照液为a和b；
a：提取鳜鱼蛙病毒的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRIV作为阳性对照；
b：以鳜鱼弹状病毒的cDNA为模板，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRV作为阳性对照；
其中，所述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如下所示：
SCRIV-MCP-F：ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTGGC；SEQ ID NO：5；
SCRIV-MCP-R：TTACAGGATGGGGAAACCCATG；SEQ ID NO：6；
SCRV-N-F：ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG；SEQ ID NO：7；
SCRV-N-R：TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC；SEQ ID NO：8。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL、引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL或SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL、鳜鱼蛙病毒的DNA模板或鳜鱼弹状病毒的cDNA模板1μL、无菌ddH2O补充至25μL；
所述PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃终延伸10min。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接中，所述回收纯化的扩增产物的体积为4μL，所述pEASY-T1载体的体积为1μL。
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