[发明专利]基于焦磷酸测序技术的FOXA1基因甲基化检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于焦磷酸测序技术的FOXA1基因甲基化检测试剂盒及检测方法。试剂盒包括FOXA1基因扩增引物FOXA1‑mF：GAGGTGGGTATTTAAGYGA和FOXA1‑mR：Biotin‑CAATACAACCATCCAACCCTA，以及测序引物FOXA1‑mS1：TTTTTTTYGTTYGGGTGG、FOXA1‑mS2：AGTTTTTTTTTTTYGTTTYG。本发明可以低成本、高通量定位定量检测FOXA1基因14个CpG位点的甲基化比例，从而精准评估FOXA1基因的甲基化水平。

技术领域

本发明属于核酸体外扩增及甲基化的定位、定量检测领域，具体涉及一种基于焦磷酸测序技术的FOXA1基因CpG岛甲基化定量检测引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康、引发死亡的重要疾病之一。近些年，通过肿瘤分期、肿瘤抗原及基因检测指导个体化放疗、化疗及靶向治疗，大大提高了患者有效治疗比率和生存率。然而，由于肿瘤的复杂性和异质性，致使临床分期、病理分类甚至分子分型相同的患者对同一治疗方案获益率差异极大，甚至引发毒副作用。由此表明癌细胞的特性并不完全由其DNA序列决定，表观遗传信息(包括组蛋白的乙酰化修饰、DNA甲基化、染色质重塑以及非编码RNA)也参与其中，并逐渐成为肿瘤分子病理研究新的热点。

DNA甲基化主要是在CpG甲基化结合蛋白(MBDs)和DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下，将甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶(C)的5’端，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。正常人类基因组中约有5000万个5-mC，其中1-2％的CpG位点呈现高度聚集状态，通常位于基因的启动子区，被称为CpG岛，其甲基化修饰异常会促进或阻滞基因的表达，调控细胞分化和个体发育。

叉头框家族蛋白A1(forkhead box proteins A1，FOXA1)广泛存在于真菌和动物体内，在胚胎发育、细胞分化、能量代谢以及免疫调节等方面都发挥着重要的作用。FOXA1作为转录因子与恶性肿瘤的发生、增殖密切相关。例如乳腺癌、肝癌、肺癌中，FOXA1可以增加E-cadherin的表达，从而抑制上皮－间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，减少癌症的发生和转移；而在白血病、甲状腺癌、前列腺癌中，FOXA1可以促进肿瘤的生长、浸润及转移。

目前基因甲基化的检测方法主要包括：甲基化特异性PCR(MSP)、荧光定量甲基化特异PCR(qMSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(MS-HRM)和重亚硫酸盐测序法(BSP)。其中MSP和qMSP仅能定性判断1-2个CpG位点是否发生甲基化；MS-HRM只能对检测片段整体甲基化情况进行分析；BSP能够准确检测目的基因中每一个CpG位点的甲基化状态，但是基于Sanger测序的BSP法仅能定性判断CpG是否发生了甲基化，无法精准定量每个CpG位点甲基化比例，且检测灵敏度低(仅能检测出当C/C+T≥20％时的甲基化)，易出现假阴性检测结果，不利于实验室或临床检测，同时，必需挑取大量克隆进行测序，不适用于大量样本的检测。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶以及双磷酸酶共同催化作用下将每次dNTP的结合与荧光信号偶联，如果与模板配对，聚合酶就可发生反应产生荧光信号。C在Na₂SO₃处理下转化为T，而5-mC不转变，因此可以用焦磷酸测序观察C/C+T比例，间接反映位点C甲基化和非甲基化比例，得出每个CpG位点甲基化程度的精确数据。焦磷酸测序技术检测通量大、灵敏度高，可以一次实现扩增子上多个CpG位点甲基化水平的定量分析，并可以设置质控监测DNA样本是否转化完全，避免假阳性结果产生，因此是检测基因甲基化的又一“金标准”。