[发明专利]一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组腺病毒，其特征在于，包括初始腺病毒载体和融合基因；

所述融合基因为BFNA，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述融合基因，由BZLF1基因和EBNA1基因组成；

所述EBNA1基因为去除重复结构域的EBNA1基因；所述BZLF1基因为去除冗余序列的BZLF1基因。

2.根据权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，所述融合基因的制备方法包括以下步骤：

1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；

2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因；

步骤1)中扩增BZLF1基因的引物包括F1和F2，所述F1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

步骤1)中扩增EBNA1基因的引物包括F3和F4，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述F4的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

步骤2)中扩增获得融合基因的引物包括F1和F4。

3.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于，所述包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA来源于B95-8 EB病毒阳性细胞。

4.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于，步骤2)中所述重叠延伸PCR的程序包括以下步骤：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸6min。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，步骤2)中所述重叠延伸PCR的体系，以50μL计，包括以下组分：2×Taq PCR预混试剂Ⅱ25μL，170ng/μL的带有粘性末端的BZLF1基因2μL，175ng/μL的带有粘性末端的EBNA12μL、引物F11μL、引物F41μL和ddH2O 19μL。

6.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述初始腺病毒载体包括pDC316-mCMV-EGFP载体。

7.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于，所述融合基因位于所述pDC316-mCMV-EGFP载体的HindⅢ和EcoRV酶切位点之间。

8.权利要求1~7任意一项所述的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

将初始腺病毒载体和所述的融合基因分别双酶切后、连接获得重组载体pDC-BFNA-EGFP；

将所述重组载体pDC-BFNA-EGFP与腺病毒大骨架载体pBHGIOXE1，3Cre共转染HEK293细胞获得重组腺病毒。

9.权利要求1~7任一项所述的重组腺病毒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。