[发明专利]一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的融合基因BFNA的制备方法，包括以下步骤：1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因。本发明中，所述重组腺病毒包括所述融合基因，对于肿瘤具有显著的抑制作用，能够延长成瘤时间，抑瘤率达到82％以上。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用。

背景技术

研究表明，EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)的感染与鼻咽癌、胃癌的发生关系密切。EB病毒感染宿主细胞包括潜伏期和裂解期，在EB病毒阳性肿瘤细胞中，病毒一般处于潜伏期，其潜伏存在及其DNA与宿主细胞整合是导致肿瘤细胞发生的重要原因，人工诱导病毒由潜伏期进入裂解期，导致肿瘤细胞裂解死亡，有望成为治疗EB病毒相关肿瘤的新手段和新方法。

即刻早期基因(BZLF1)所编码的蛋白是一种转录激活因子，BZLF1的表达可诱导病毒从潜伏期进入裂解期，将BZLF1重组后，感染EBV阳性肿瘤细胞，可以诱导肿瘤细胞中处于潜伏期的EB病毒进入裂解期，并开启病毒复制机制，导致EB病毒阳性肿瘤细胞裂解死亡，达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用。

在鼻咽癌细胞中，EBV以Ⅱ型隐性感染状态存在，主要表达EBNA1、LMP1和LMP2(见图1)。EBNA1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)是唯一在所有EBV相关肿瘤中均表达的蛋白，当病毒潜伏感染时，EBNA1在基因组的维持、复制和转录过程中发挥重要作用。

另外，2016年，Noh等(Noh K.W,Park J,Kang MS.Targeted disruption of EBNA1in EBV-infected cells attenuated cell growth[J].BMB Rep,2016,49(4):226-231.)研究以EBNA1为靶点，利用转录激活诱导剂E1TN诱导EBNA1基因表达，结果表明，E1TN诱导法能诱导EBV阳性的B淋巴细胞逐渐凋亡，而EBV阴性细胞未受到任何影响，该方法为EBV相关肿瘤治疗提供了新思路。但是目前缺乏高效的治疗手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用；所述融合基因是将去除重复结构域的EBNA1基因与去除庸余序列的BZLF1基因进行融合获得；包括所述融合基因BFNA的重组腺病毒能够显著的抑制肿瘤，提高机体中CD4⁺T和CD8⁺T等免疫细胞的含量。

本发明提供了一种融合基因BFNA，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明提供了所述的融合基因BFNA的制备方法，包括以下步骤：

1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；

2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因；

步骤1)中扩增BZLF1基因的引物包括F1和F2，所述F1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

步骤1)中扩增EBNA1基因的引物包括F3和F4，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述F4的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；