[发明专利]PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法及应用

说明书

一种PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法及应用，一种PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法包括如下步骤：采集血清样本、设置零孔、在标准品孔及样本孔中加入标准品及血清、每孔加入生物素标记抗体工作液、将板内液体甩干后加液、将板内液体甩干后在其余每孔中加入TMB显色液、在其余每孔中加入终止液、用酶标仪测量板内各孔OD值、计算出三种蛋白浓度。MIG对于喉癌的发生有着重要意义，可为喉癌诊断提供重要依据，可弥补内镜和影像学检查的不足，减少有创检查，提高喉癌诊断的灵敏度与特异度。

技术领域

本发明涉及一种检测方法及应用，特别是一种PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法及应用。

背景技术

喉癌是头颈部的常见恶性肿瘤之一，影响喉癌的发生因素很多，主要的影响因素为吸烟和饮酒，它的早期没有特异性的临床表现，有患者仅可表现为声音嘶哑，咽喉部异物感等症状，不易引起患者重视。由于喉部在呼吸和发声方面的重要功能，喉癌可严重影响患者的日常生活。

现阶段研究中发现许多与喉癌密切相关的标志物，例如血清肿瘤标志物Cyfra21-1,CA724,CA199,SCCAg,TK1等，但是都缺乏高度特异性及敏感度而无法在临床上进行广泛推广。需要更多的研究来确定新的基于血清的肿瘤标志物，这些肿瘤标志物可能被用于筛查喉癌早期诊断的一般或高危人群，或预测CRC的预后和治疗反应，因此对喉癌肿瘤标志物的寻找有非常大的临床应用价值，是现今喉癌诊断研究的重点和热门。

发明内容

本发明的目的是提供一种PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法。

实现本发明上述目的的技术方案是：一种PRL、PIGF及NGFR表达量的检测方法，包括如下步骤：

一、采集血清样本；

二、按照样本量设置零孔，TMB显色孔，标准品孔及样本孔，并标识；

三、用移液枪分别在标准品孔及样本孔中加入标准品及血清100ul，注意不要碰触到孔壁和孔底,盖上板贴，至37℃恒温箱中孵育2h。

四、标准品孔及样本孔中每孔加入生物素标记抗体工作液100 ul，注意不要碰触到孔壁和孔底，盖上新板贴，放置于37℃恒温箱中，静置1 h；

五、将板内液体甩干，孔内未见明显附壁水滴，洗板3次，每孔加入洗液工作液200ul，浸泡2min。洗板后在滤纸上拍干，可见孔壁和孔底未见明显附壁水滴；

六、用移液枪分别在先前设置的标准品孔及样本孔中加液，每孔加入过氧化物酶标记亲和素工作液100 ul，注意不要碰触到孔壁和孔底。盖上新板贴，置于恒温箱中，温度恒定37℃，静置1 h；

七、将板内液体甩干，孔内未见明显附壁水滴，洗板5次，每孔加入洗液工作液200ul，浸泡2min。洗板后在滤纸上拍干，可见孔壁和孔底未见明显附壁水滴；

八、除空白孔外，用移液枪在其余每孔中加入TMB显色液90ul，注意不要碰触到孔壁和孔底，在37℃恒温箱中避光显色25min；

九、看到标准品孔中有明显颜色反应后。除空白孔外，在其余每孔中加入终止液50ul；

十、加入终止液后可见孔内液体转为黄色，观察到反应后5min内，用酶标仪测量板内各孔OD值，设定测量波长为450nm；

十一、计算出三种蛋白浓度。

本发明实验所用的ELISA法检测MIG检测试剂盒由上海华美生物有限公司提供。