[发明专利]感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法

说明书

本发明提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，包括如下步骤：（1）利用解剖学结构获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出施万细胞并收集；（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出成纤维细胞并收集。本发明建立了一种快速高效的体外纯化培养感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的方法，为深入研究周围神经特异性再生的机制提供有力的支撑。

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法。

背景技术

周围神经损伤的修复一直是临床治疗的一个难题，虽然随着显微外科学的发展，在神经缺损的桥接吻合方面取得了一定的进展，但神经功能恢复的效果仍不理想，其原因主要由于再生的神经未能准确地、选择性地再支配靶组织器官（感觉神经末梢和运动终板），即错向生长：如感觉神经轴突错向长入运动支的神经内膜管，运动神经轴突错向长入感觉支的神经内膜管。因此，充分理解周围神经特异性再生的细胞和分子生物学基础，在临床治疗中加以运用以促进周围神经功能更好的恢复具有非常重要的意义。

周围神经主要由神经元的轴突、包绕在轴突上的施万细胞（SCs）和成纤维细胞（Fbs）组成。在神经损伤再生过程中，再生轴突沿着特定的通路延伸，而神经突起特异性引导延伸的现象是由于神经元、施万细胞和成纤维细胞之间复杂而精确的相互作用。成纤维细胞是组成神经内膜、神经外膜和神经束膜的主要成份，施万细胞仅在神经内膜中表达。

体外培养成纤维细胞和施万细胞有助于研究周围神经特异性再生的细胞与分子机制。目前常用的纯化培养施万细胞和成纤维细胞的方法有阿糖胞苷处理法和补体抗体法，以上方法均去除了成纤维细胞仅获得高纯度的施万细胞。流式细胞分选法虽然可以同时获得高纯度的施万细胞和成纤维细胞，但是需要价格昂贵的流式分选仪，同时需要耗费大量的细胞，并且分选后细胞得率也很低。差速贴壁法是利用成纤维细胞和施万细胞对多聚赖氨酸的黏附能力不同对两种细胞进行分离，但是纯化后两种细胞的纯度不如其他方法获得的纯度高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，能快速高效地体外纯化培养感觉与运动神经来源施万细胞和成纤维细胞，为深入研究周围神经特异性再生的机制提供有力的支撑。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，包括如下步骤：

（1）利用解剖学结构获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；

（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出施万细胞并收集；

（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出成纤维细胞并收集。

其中，步骤（2）的具体步骤为：在培养皿中加入0.25%胰酶停留10s后迅速加入完全培养基终止消化，施万细胞变圆，轻轻吹打细胞，施万细胞脱落，而成纤维细胞仍然紧贴皿底，收集施万细胞接种培养30min，至施万细胞中夹杂的少量成纤维细胞已经贴壁，通过差速贴壁法收集含未贴壁施万细胞的上清接种在多聚赖氨酸预包被的培养皿中培养，培养2天后重复步骤（2）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集施万细胞。

其中，步骤（3）的具体步骤为：步骤（2）中经差速消化法去除施万细胞后，培养皿中剩余的成纤维细胞加入0.25% 胰酶消化2-4min，加入完全培养基终止消化，收集成纤维细胞，然后离心接种在培养皿中培养30 min，至大部分成纤维细胞已经贴壁，弃去上清中残留的少量施万细胞，加完全培养基培养2天后重复步骤（3）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集成纤维细胞。

其中，所述的施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法还包括步骤（4）感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度鉴定。