[发明专利]一种生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌

说明书

本发明涉及一种用于生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌，所述工程菌能发酵生产GGPP，通过将不同植物来源的II类二萜合酶基因和I类二萜合酶基因插入到底盘菌中，如将来源于毛喉鞘蕊花的CfTPS1和来源于丹参的SmCPS1二萜合酶进行组合，可获得高产丹参酮二烯的重组工程菌，而当将二者以SmCPS1‑CfTPS1形式融合时，次丹参酮二烯产量可以进一步升高。

背景技术

在自然界中，许多二萜类化合物具有重要的药用或生物学活性，但因其结构的复杂性，很难通过化学合成的手段获得。二萜类化合物按照骨架可以分为克罗烷型(clerodane)、半日花烷型(labdane)、海松烷型(pimarane)、松香烷型(abietane)以及贝壳杉烷型(kaurane)二萜^1-3。在植物体内，甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径和4-磷酸-2-甲基赤藓糖(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径产生成异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)及其同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate,DMAPP)，在牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase,GGPPS)的催化下，IPP和DMAPP缩合生成二萜类化合物的共同前体物质牻牛儿牻牛儿焦磷酸((E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate,GGPP)(图1-1)⁴。许多松香烷型二萜具有重要的药用价值，例如，来源于中药植物雷公藤的雷公藤甲素，具有显著的抗炎、抗肿瘤、免疫调节等活性，其成药已经处于I和II期临床试验阶段；以及来源于丹参的丹参酮类成分，具有心血管保护、抗氧化和抗肿瘤等显著药理活性^5-8。

尽管二萜类化合物具有广阔的应用前景，但其在天然植物组织中的含量较低，提取工艺繁琐且效率低下，严重限制了其进一步的开发和应用。相比之下，利用微生物进行天然产物的异源生产不仅可以保护自然资源还可以实现重要化合物的高效生产，如青蒿素的前体物质青蒿酸和紫杉醇的重要前体物质紫杉二烯^9-10。充足的前体供给对实现二萜类化合物的途径重构和高效生产至关重要。松香完型二萜广泛存在于药用植物中，是合成多种二萜化合物的重要中间体，如雷公藤甲素、丹参酮、鼠尾草酸、鼠尾草酚、红砂烷内酯A-D等^11-19。中国专利CN108395997中公开了一种高产二萜类成分的酵母工程菌，并在酿酒酵母中重构次丹参酮二烯的生物合成途径，将来源于丹参的两条二萜合酶基因(SmCPS1、SmKSL1)进行模块化途径工程优化，摇瓶发酵水平达到93.63mg/L的水平，在15L的发酵罐中获得了365mg/L的次丹参酮二烯²⁰；随后，戴住波等人通过质粒过表达参与GGPP生物合成途径的关键基因，增加前体物质FPP和GGPP的代谢流，使次丹参酮二烯的摇瓶发酵水平达到61.8mg/L，继而通过发酵罐高密度发酵，产量进一步提高到488mg/L²¹。然而，这样的产量仍然达不到工业生产级别。