[发明专利]一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和应用，以6对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成，并通过全外显子测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的肿瘤突变负荷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；本产品可以用于肿瘤突变负荷检测产品的性能评价，也可以用于肿瘤突变负荷的算法优化或检测流程优化。适用于高通量中的全外显子、靶向基因组或外显子组子集的测序策略。

技术领域

本发明涉及肿瘤基因突变检测领域，具体涉及一种肿瘤突变负荷（TumorMutation Burden，TMB）标准品及其制备方法和试剂盒。

背景技术

近年来，受国家政策的大力推动和技术的不断更替，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测，肿瘤易感预测，肿瘤早期诊断，个体化用药，术后监测以及消费型基因检测等。由于市场容量巨大，近年来，市场上出现了越来越多的此类基因检测的试剂盒。而肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden，TMB）作为一个潜在的生物标志物而出现，业内公司也争相推出相关检测。如何测准肿瘤突变负荷也是一直困扰相关检测行业的一大难题。

TMB定义为一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb~超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子测序（WES）方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。2018年欧洲肿瘤医学协会会议（ESMO）上，Foundation Medicine（FMI）展示的研究结果是在全球范围内首次在III期临床试验中证实：无论PD-L1表达水平如何，只要非小细胞肺癌患者的TMB高，联合免疫治疗都能够给他们带来无进展生存期显著获益。也是首个证实TMB可以作为免疫治疗效果预测伴随诊断方法的前瞻性临床研究。另一项并列开展中的CheckMate568也表明，在接受Nivolumab加ipilimumab治疗的非小细胞肺癌患者，TMB≥10 mut/Mb的患者中位无进展生存期几乎是TMB＜10 mut/Mb患者的3倍（7.1月 vs 2.6月），无论PD-L1表达水平如何。正是基于这些研究成果，在2019年推出的非小细胞肺癌NCCN指南中，TMB赫然在列，成为非小细胞肺癌患者接受免疫治疗的推荐检测方法。

TMB作为潜在生物标志物来预测免疫治疗的疗效预测。有些TMB非常高的患者对免疫治疗也没有反应，有些TMB低的患者使用免疫检查点抑制剂效果却很好。这意味着，除了TMB之外，患者对免疫治疗的响应程度还与其他多种因素有关。这也提示，将TMB与其他的标志物联合使用可能会提升TMB的预测能力。但目前针对TMB的检测存在诸多问题，比如利用在靶向基因组或外显子组子集进行TMB的计算，同义突变及非同义突变是否同时纳入计算存在争议，不同的样品的类型、处理方法和不同的生物信息学算法也影响着TMB值。TMB检测亟需一个标准化的参考品去校准及优化。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种肿瘤突变负荷（TMB）检测的标准品，所述标准品含有选自如下6对配对细胞系的基因组DNA（gDNA）：

其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述6对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞，所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。