[发明专利]一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法

权利要求书

1.一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：

1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织于75％酒精消毒30s后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm³大小的组织块，离心后，于培养基中在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养；每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养；

1.2)传代培养：贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代培养；

1.3)培养上清收集：取适合代次细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为无血清培养基培养，收集培养上清液；

2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：

2.1)初次离心：无菌条件下，将收集的上清液离心，去除死细胞和体积较大的细胞碎片；

2.2)二次离心：通过离心去除死细胞和细胞碎片；

2.3)去除细胞器离心：通过离心去除细胞器及小颗粒，并于0.22μm滤器过滤；

2.4)外泌体粗提：滤过后液体转移至超速离心管中，离心后去除上清液，获得粗提外泌体；

2.5)外泌体终提：用1ml生理盐水重悬沉淀，离心后弃上清，生理盐水溶解沉淀，即得到人脐带间充质干细胞外泌体，置于-80℃保存待用；

3)凝胶材料制备：

3.1)壳聚糖制备：取医用级壳聚糖粉末,加入乙酸中，磁力搅拌器搅拌后，4℃放置保存；

3.2)β-GP配置：β-GP溶解于无菌注射用水中，震荡搅拌，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；

3.3)凝胶材料制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将β-GP溶液逐步滴加至壳聚糖溶液，持续搅拌8-10min，即得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料；

4)凝胶负载外泌体：将干细胞外泌体和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶以1:3比例混合并搅拌均匀；外泌体负载完成后，将负载干细胞外泌体的凝胶置于4℃保存待用。

2.根据权利要求1所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1.1)中，离心条件为室温，200-300g转速离心5-8min。

3.根据权利要求2所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，原代和传代细胞培养基为含体积分数5-15％胎牛血清的α-MEM培养基。

4.根据权利要求3所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，培养上清收集所需适合代次细胞为P3-P6,培养上清收集所更换的培养基为无血清培养基MSC Xeno-Free SFM,更换培养基后细胞再培养24～72h后收集培养上清液。

5.根据权利要求4所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2.1)中，初次离心条件为4℃，200-300g，5-15min；所述步骤2.2)中，二次离心条件为4℃，1500-2500g，5-10min；所述步骤2.3)中，去除细胞器离心条件为4℃，8000-12000g，20-40min。

6.根据权利要求5所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2.4)中，外泌体粗提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min，所述步骤2.5)中，外泌体终提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min；溶解条件为，50-150μL生理盐水溶解。

7.根据权利要求6所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，严格控制所收集上清细胞的培养条件，保证培养条件一致性；每次收集600-800ml干细胞上清液，将获得的干细胞上清按照以上步骤进行干细胞外泌体的提取。