[发明专利]一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法

说明书

本发明涉及一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法。该方法包括以下步骤：1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取；1.2)传代培养；1.3)培养上清收集；2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：2.1)初次离心；2.2)二次离心；2.3)去除细胞器离心；2.4)外泌体粗提；2.5)外泌体终提；3)凝胶材料制备：3.1)壳聚糖制备；3.2)β‑GP配置；3.3)凝胶材料制备；4)凝胶负载外泌体。本发明可促进皮肤创面修复，缩短伤口愈合时间及减少瘢痕形成。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法及其应用。

背景技术

皮肤软组织创面的修复是一个涉及炎症，增殖和组织重塑等因素的多阶段过程，且各个阶段截然不同又彼此重叠。参与此过程的生长因子，细胞因子，趋化因子和各种细胞以复杂精密的方式相互作用。然而，这些阶段和因素中任何一项失衡都可能引起正常伤口愈合过程的协调性被破坏，最终导致慢性不愈伤口的转归和异常疤痕的形成。例如在糖尿病、感染或辐射暴露等情况下，人体细胞和分子信号的破坏都可能会引发创面迁延不愈或慢性愈合。

虽然皮肤软组织创伤很普遍，但是迁延不愈的慢性伤口，如大面积损伤、糖尿病等慢性病引起较严重的皮肤溃疡等情况，更可能造成疤痕形成或愈合质量差强人意的结局，不仅后期会导致组织功能的障碍，还会影响患者的心理健康。因此，在皮肤软组织创伤恢复中，如何缩短愈合时间并减少疤痕形成，是近年临床应用中较为迫切的需求。现阶段针对皮肤创伤修复的主要手段包括植皮、激光治疗、生长因子或细胞因子的应用以及基因治疗等。但是这些方法都有导致萎缩性瘢痕、色素异常、皮肤坏死和其他不良后果的可能性。另外，局部注射因子很容易被体液降解，并且其在损伤部位的剂量和浓度高度易变。因此，有必要寻找一种新型稳定，有效和安全的治疗方法来促进软组织创面的愈合。

间充质干细胞能促进组织修复和再生，改善创面愈合，一度是当下的热门研究领域之一。近期研究发现，间充质干细胞的疗效主要来源于其旁分泌的产物----外泌体(exosomes，EXOs)。间充质干细胞来源的外泌体能够避免干细胞治疗过程中的免疫原性、致瘤性、阻塞血管管腔等风险，且具有性质稳定，剂量和浓度易控制，具有生物归巢作用，易于储存等优势，成为近年研究的热点方向。外泌体是一种直径30-100nm的膜性脂质小囊泡，除了富含蛋白质、mRNA及miRNA外，还含有大量细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸等。其中间充质干细胞所分泌的外泌体包含的蛋白或RNA成分与受损细胞进行信息交流，可对靶细胞进行生物学功能调控，有效地修复如心肌缺血再灌注损伤、肝纤维化、急性肾损伤以及调节皮肤创面的愈合等。特别在调节皮肤创面愈合方面，间充质干细胞外泌体对皮肤成纤维细胞的调控功能具有促进伤口愈合与抑制瘢痕形成的双向调节作用。即在伤口愈合的早期通过促进胶原的合成来提高修复速度，晚期则减少胶原的合成而抑制瘢痕组织的形成，提升修复效果。

考虑到慢性伤口的炎性环境可能会阻碍活性物质促进创伤愈合的进程，已有研究者着力于适合的生物材料开发，将生物材料作为递送系统，携带活性物质促进皮肤伤口的愈合。因此基于开发可行和有效的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法及其应用，是本发明探索和期望解决的主要问题。