[发明专利]一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法

权利要求书

1.一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

S1：细菌培养：将被污染的菌株接种于EC肉汤培养基中，过夜培养，备用；

S2：细菌纯化：将S1中培养后的细菌进行如下处理：伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→纯化结果初步鉴定；

S3：细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16srDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；

S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。

2.根据权利要求1所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述的S1中，每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2～4μL菌液，培养温度为40～42℃，转速为180～220rpm，培养时间为18～24h。

3.根据权利要求1所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S2的详细步骤为：

S2.1，利用伊红美蓝平板选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于伊红美蓝平板，尽可能多的划出单菌落，35～37℃，培养18～24h；

S2.2，利用麦康凯平板首次纯化，

挑取S2.1中伊红美蓝平板培养得到的绿色有金属光泽的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；

S2.3，麦康凯平板二次纯化，

挑取麦康凯平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落，

S2.4，LB平板活化，

挑取麦康凯二次纯化平板粉红色或者紫红色的单菌落，三笔划线于麦康凯平板，尽可能多的划出单菌落；

S2.5，通过观察菌落形态进行纯化结果初步鉴定，

观察纯化后的LB平板，菌落是否均一，是否有一层菌膜覆盖；若菌落均一，且无菌膜覆盖，则进行下一步试验；若菌落不均一或有菌膜覆盖，则重复以上操作，再次进行纯化。

4.根据权利要求3所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S2.1～S2.4中所述培养温度为35～37℃，培养时间都为18～24h。

5.根据权利要求1～4任一项所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述S3具体的鉴定方法为：

S3.1，对S2中纯化后的菌株进行stx1/2基因鉴定

S3.2，对S2中纯化后的菌株进行16s rDNA鉴定，

S3.3，将S3.2中鉴定为阳性的PCR产物进行双向测序，并将双向测序结果与NCBI数据库进行比对，当S3.1的结果为阳性，且测序结果比对为大肠杆菌，则表明菌株纯化完成。

6.根据权利要求5所述的被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，其特征在于，所述步骤S3.1中的stx1/2基因鉴定的步骤为：

S3.1.1，DNA模板的制备；

S3.1.2，PCR扩增stx1/2基因，反应体系为：DNA模板5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl₂1.5μL，dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，上下游引物各为0.3μL，ddH₂O 13.275μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；

S3.1.3，利用凝胶电泳及成像进行鉴别。