[发明专利]一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法

说明书

本发明公开了一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，属于微生物技术领域。该方法主要包括细菌培养、细菌纯化、细菌鉴定和细菌保藏四个步骤。该方法简单、耗时短，成本低，鉴定结果准确、可靠。其中细菌培养及纯化依次采用EC肉汤培养基、伊红美蓝琼脂培养基和两次麦康凯琼脂培养基，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离；细菌鉴定主要包括：LB平板菌落形态初筛，扩增stx1或stx2基因阳性，扩增16s rDNA并将阳性扩增产物进行双向测序，最后将测序结果与NCBI数据库进行比较，最终确认纯化结果。

技术领域

本发明微生物检测分离技术领域，具体涉及一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法。

背景技术

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)是近年来发现的一种重要的并且能够引起人类潜在致命性疾病的食源性致病菌。人们感染STEC通常由于进食生的或未熟的肉类、生牛奶或被污染的蔬菜水果，也有在屠宰牲畜和生肉加工时被感染。被感染的人们常常伴有腹泻、出血性肠炎(Hemorrhagiccolitis，HC)等症状，并且容易引起继发性的溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)，严重可引发人类死亡。而感染STEC的主要宿主是反刍动物尤其是牛。但是牛缺乏志贺毒素受体，即使感染STEC后也不会出现临床症状，多表现为健康带菌，因此不少国家都很重视对动物，特别是牛群中STEC感染情况的流行病学调查。

为了解陕西省某奶牛场STEC的污染情况，我们对不同年龄及产量的奶牛的新鲜粪便进行了收集。在对牛粪样本STEC菌株分离时，我们发现stx1/2基因扩增为阳性的菌株，常常被一种菌膜覆盖，经初步判断怀疑STEC菌株被变形杆菌所污染。为了解STEC菌株的污染情况及菌株的分子特性，将被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌进行有效的纯化，是一个需要解决的问题。

因此，为了得到单一的STEC菌株，我们对被污染的STEC菌株进行纯化。鉴定步骤为：细菌培养→伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→观察菌落形态初步鉴定→stx1/2基因鉴定→16s rDNA鉴定。该方法操作简单，菌落形态清晰，便于挑取分离，成本较低且准确性高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，可以快速、准确的将产志贺毒素大肠埃希氏菌从污染菌株中分离。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种被变形杆菌污染的产志贺毒素大肠埃希氏菌的纯化方法，具体按照以下步骤实施：

S1：细菌培养，将被污染的菌株接种于EC肉汤培养基中，过夜培养，备用；

S2：细菌纯化：将S1中培养后的细菌进行如下处理：伊红美蓝平板选择培养→麦康凯平板首次纯化→麦康凯平板二次纯化→LB平板活化→纯化结果初步鉴定；

S3：细菌鉴定：将S2中纯化得到的菌株利用PCR扩增stx1/2和16s rDNA基因，并对16s rDNA阳性扩增产物进行双向测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对分析；

S4：将经S3鉴定后确定为产志贺毒素大肠埃希氏菌的菌株进行保藏。

作为本发明进一步的方案：所述的S1中，每1ml无菌EC肉汤培养基中加入2～4μL菌液，培养温度为40～42℃，转速为180～220rpm，培养时间为18～24h。

作为本发明再进一步的方案：所述S2的详细步骤为：

S2.1，利用伊红美蓝平板选择培养，将培养好的菌液，涡旋振荡5～10s，用接种环挑取一环，三笔划线于伊红美蓝平板，尽可能多的划出单菌落，35～37℃，培养18～24h；

S2.2，利用麦康凯平板首次纯化，