[发明专利]猪乙型脑炎疫苗抗原规模培养方法

说明书

本发明公开了一种猪乙型脑炎疫苗抗原规模培养方法。本发明提供了一种猪乙型脑炎疫苗抗原大规模培养工艺，使用猪肾细胞PK‑15细胞培养猪乙型脑炎病毒，病毒接种一次可以连续收获多个批次的病毒，且病毒效价与BHK‑21、VERO细胞相当或高于现有培养工艺，极大的提高了病毒产量，降低了生产成本，是一种适宜规模化生产的猪乙型脑炎疫苗抗原培养工艺。

技术领域

本发明涉及生物疫苗领域，具体涉及一种猪乙型脑炎疫苗抗原规模培养方法。

背景技术

猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)可引起乙型脑炎疾病，乙型脑炎是一种经蚊虫传播的人畜共患病，是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是猪乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源。猪乙型脑炎病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，目前主要通过免疫接种的方式来预防。猪乙型脑炎病毒可在多种组织培养细胞内增殖，其中BHK-21、Vero及C6/36等细胞敏感性较高，可用于JEV的培养。JEV在BHK-21、VERO细胞等细胞中生长可导致细胞发生病变，导致细胞死亡。常规培养方法培养JEV病毒接种一次只能收获一次病毒，成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种适宜规模化生产的猪乙型脑炎疫苗抗原培养工艺。

第一方面，本发明保护一种猪乙型脑炎疫苗抗原培养方法，包括如下步骤：

(1)将猪乙型脑炎病毒接种于PK-15细胞，接种的病毒量为0.4～10MOI；

(2)完成步骤(1)后，继续培养细胞48h后开始连续收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。

所述方法中，接种的病毒量具体可为0.6～3MOI。进一步地，接种的病毒量具体可为0.6～1MOI。示例性地，所述病毒量具体为1MOI或0.6MOI。

所述方法中，具体在继续培养细胞的第48h至192h期间连续收获病毒，每次收获病毒间隔24h或48h或72h；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。

在本发明的实施例中，最佳方法为分别在继续培养细胞的第48h、96h、120h、144h、168h和192h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。

示例性地，收毒方法还可为在继续培养细胞的第48h、96h、144h和192h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。

示例性地，收毒方法还可为在继续培养细胞的第48h和120h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。

所述方法中，所述病毒可以通过病毒液的形式接种至PK-15细胞；所述病毒液具体可采用含有体积百分含量0％-2％小牛血清的细胞培养液配置。其中采用含有体积百分含量2％小牛血清的细胞培养液配置为佳。所述病毒液的浓度具体可为2.5×10^5.8～8×10^6.8TCID₅₀/ml。进一步地，所述病毒液的浓度具体可为5×10^5.8TCID₅₀/ml～2×10^6.8TCID₅₀/ml。示例性地，所述病毒液的浓度为5×10^5.8TCID₅₀/ml。