[发明专利]一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法

说明书

本发明基于重组酶聚合酶扩增技术对半乳糖进行检测,可用于对食品等生物样品含有的半乳糖成分进行定性、定量的检测方法，该方法结合重组酶聚合酶对核酸模板指数放大的特点与半乳糖阻遏蛋白对扩增的抑制作用,利用半乳糖特异性调节半乳糖阻遏蛋白抑制作用的效果，开发出半乳糖对重组酶聚合酶扩增的“开关式”调控方法，通过对扩增产物检测进而特异性检测溶液中半乳糖成分并进行定量。该发明提出了一种能在生物样品中经济、快捷、方便的特异性检测半乳糖的新式方法。

技术领域

本发明涉及生物样品检测领域，主要涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的检测半乳糖的方法，该方法可用于对食品等生物样品中的半乳糖定性、定量分析。

背景技术

半乳糖是一种天然醛己糖，主要以D-构型存在。人体通过各种乳制品及非乳制品食物获得(如水果、蔬菜、谷物、油料类等)，其游离的或结合的半乳糖形式(例如低聚糖和多糖、糖蛋白和糖脂)，并在人体内作为碳水化合物参与正常代谢同时作为促进婴幼儿脑部神经发育的重要物质。

乳糖占牛奶中的2-8％，作为婴幼儿断乳前的主要能量来源，正常情况下，摄入后，在小肠分解成单糖，分解的半乳糖经半乳糖激酶、半乳糖1-磷酸尿嘧啶转移酶、和尿苷二磷酸半乳糖-4'表异构酶的作用进入糖酵解过程，当这些酶其中一种在体内无法被有效合成时都会导致半乳糖在体内的堆积形成半乳糖血症，使患儿遭受各种健康困扰如白内障，肝脏疾病，肾脏，大脑损害等问题等。实施在饮食中限制半乳糖是有益的措施，大大降低了这类患儿严重的临床症状。但值得注意的是所有年龄段的患者终生都必须接受半乳糖限制饮食。

半乳糖与葡萄糖缩合成的乳糖作为一种甜味剂已广泛添加入各种加工食物中，例如饼干，糖果，奶油，奶酪等，准确定性各种食品中的半乳糖成分，有利于规避对半乳糖血症患者的食品安全问题。

以牛奶为基础的乳制品在食品市场上占据了优势地位，它除了含有半乳糖外，还具备大量的优质蛋白，矿物质元素等。为解决半乳糖血症患者食用这些产品的健康问题，乳制品公司已开发相应策略，生产不含乳糖和不含半乳糖的乳制品。但评估这些产品中剩余半乳糖的含量是必要的，不仅为半乳糖血症患者提供食品安全支持依据，并能对去除半乳糖的相关工艺进行质量测评。

组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是2006年由英国Twist Dx Inc公司研发的一种核酸等温扩增技术。RPA技术由重组酶与引物结合形成的复合物在模板上寻找同源序列，定位后引发链交换反应，启动DNA的合成，对模板上的目的片段进行指数扩增。RPA技术在25℃-42℃的恒温条件下即可快速完成核酸的扩增，其扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法结合进行检测。该技术与其它核酸体外扩增技术相比，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简便等特点，且与常规PCR相比，RPA不用通过变性、退火、延伸三个不同温度环节进行复制扩增，可以在常温下进行等温扩增，无需变性，也不需要温控设备,对仪器的依赖性不，除了传统的反应管，还可以在纸片上进行试验。RPA是目前可用于即时诊断最方便快捷的核酸检测方法之一。

目前应用在食品科学领域检测半乳糖有两种通用的分析方法即通过液体或气体分离的色谱法和基于半乳糖氧化酶(GalOx)或半乳糖脱氢酶(GADH)结合使用分光光度法、偏光法和荧光法检测酶产物。但是，这些方法通常操作繁琐且昂贵，耗时，并且经常需要熟练的技术人员操作它们。因此，开发一种可快速准确的检测半乳糖方法一直是亟待解决的新课题，开发一种新的便捷、快速、准确的检测半乳糖的方法，对于食品安全监测、食品化工生产等领域都有重要意义。

发明内容