[发明专利]基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于PCR‑RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，属于遗传工程技术领域。包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)扩增鼠线粒体Cyt‑b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行快速酶切；(5)将酶切产物1.5％琼脂糖凝胶电泳后在荧光成像系统中进行图谱分析。本发明方法具备快速、准确和廉价的优势，对人员技术、设备和试剂的成本要求较低。可以同时鉴定常见的三种鼠种，遗传物质来源广，具有很大的应用推广价值。

技术领域

本发明涉及家栖鼠鼠种的鉴定方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

鼠类动物，作为哺乳动物中繁殖最块、生存能力超强的有害动物，不仅给农业和畜牧业造成直接影响，还因其可携带、传播多种病原体，给公众健康带来巨大威胁。我国北方三大家栖鼠主要包括褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)和黄胸鼠(Rattus tanezumi)，鼠种的鉴定对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择等至关重要，从而直接影响防鼠灭鼠的效果。传统形态学的鼠种鉴定方法虽然经典但也存在诸多局限性，对鉴定人员的知识储存和鼠形态完整度均有着较高要求，而鼠的形态特征也可能随着生态学的不断变化而发生变化，给鼠种的鉴定提出了更高的要求。因此迫切需要一种准确的分子生物学鉴定方法来作为传统形态学鉴定方法的补充。随着分子生物学的不断发展和应用，其在鼠种鉴定中可发挥重要作用，如在只有鼠排泄物的条件系即可通过分子鉴定的手段快速获得鼠种的准确信息。

中国专利CN105177153A公开了一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法，其公开了一组PCR鉴定引物及鉴定方法，但是该方法只适用于黄胸鼠鼠种的鉴定，不能同时鉴定常见的三种鼠种；其所利用的遗传物质来源为鼠尾部末端组织，遗传物质来源受限。

中国专利CN109943644A公开了一种鼠种的分子鉴定方法，同时用特异引物分别扩增两组线粒体基因：但是该方法的PCR产物需要经过纯化回收，且经测序公司测序并进行核酸序列比对后，才能判断鼠种，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高，在应用中有其局限性。

中国专利CN105385699A公开了三峡库区沿江口岸4种鼠类Cyt-b基因的特异性序列及分子鉴定方法，4种鼠类包括黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠和黑线姬鼠，然而，该发明同样需要进行基因测序和序列比对，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明拟通过利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)联合限制性片段长度多态性(Restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)的分子生物学手段，建立我国三大家栖鼠(褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠)鼠种快速鉴定的方法。可克服传统形态学鉴定方法的局限性，且对鉴定人员的专业分类知识要求不高，用于形态相似或外形难以判别的家栖鼠的鉴定；此外，该方法对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择均有重要作用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；

步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：

序列为SEQ ID NO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；