[发明专利]检测喷气燃料中硫酸盐还原菌引物、应用及检测方法

权利要求书

1.一种检测硫酸盐还原菌的引物，其特征在于，包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，两条环引物LB和LF；

所述的外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，所述的外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，所述的内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示，所述的环引物LB序列如SEQ ID NO.5所示，所述的环引物LF序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的检测硫酸盐还原菌的引物，其特征在于，内引物FIP的5’端进行生物素标记，环引物LF的5’端进行异硫氰酸荧光素标记作为探针。

3.一种硫酸盐还原菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

以硫酸盐还原菌的基因组DNA作为模板进行扩增，LAMP反应体系引物浓度为：F3和B3各0.2μmol/L，FIP和BIP各1.6μmol/L，LF、LB各0.8μmol/L；LAMP预混液为，20mmol/LTris-HCl(pH8.8)，10mmol/LKCl，8mmol/LMgSO₄，10mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1％吐温20，0.8mol/LBetaine，1.4mmol/LdNTPs，8U/μLBstDNA聚合酶；

硫酸盐还原菌的LAMP反应体系为：LAMP预混液：10ml，FIP：2.5ml，BIP：2.5ml，LB：0.95ml，LF：0.95，F3：0.3ml，B3：0.3ml，待测样品DNA模板：2ml；去离子水：0.5ml；

采用引物和LAMP反应体系，温度为65℃下进行LAMP扩增反应25min，LAMP扩增反应结束后，取LAMP反应产物8μL，加入到100μLLFD分析缓冲液中得到混合溶液，将LFD试纸条插入所述的混合溶液中，等待1min，取出试纸条观察结果，如果LFD试纸条呈阳性，表示待测样品中含有硫酸盐还原菌；如果LFD试纸条呈阴性，表示待测样品中不含有硫酸盐还原菌；

所述的引物为权利要求1或2所述的引物。

4.一种检测硫酸盐还原菌的检测方法在喷气燃料真菌检测中的应用，其特征在于，所述的检测方法为权利要求3中所述的检测方法。

5.根据权利要求4所述的检测硫酸盐还原菌的检测方法在喷气燃料真菌检测中的应用，其特征在于，取喷气燃料样品500mL经0.22μm滤膜抽滤，收集滤膜并用1mL10％的Chelex-100溶液反复洗脱，洗脱液收集于1.5mL的离心管内，后将离心管放入金属浴中100℃恒温5min，然后将离心管放入－20℃冰箱5min，重复三次，最后离心管经12000r/min离心5min，吸取上清液至新的1.5mL离心管中，得到待测样品DNA模板，用于检测。