[发明专利]一种新的RNA高通量测序的方法、引物组和试剂盒及其应用

权利要求书

1.用于RNA高通量测序的方法，包括以下步骤：

（1）获得1个以上样品的RNA；

（2）用二代测序平台相兼容、测序文库5’端序列相偶联的反转录引物对步骤（1）所得RNA进行反转录，以使poly A选择和反转录合成第一条cDNA链同步完成，得到反转录产物；

（3）反转录第一条cDNA链之后，进行RNA裂解，将样品中的RNA清除；

（4）用二代测序平台相兼容测序文库3’接头的引物合成第二条cDNA链，得到双链cDNA；

（5）在第二链cDNA合成之前或之后，合并多个平行操作的样品的产物到一个试管中，然后纯化、浓缩；

（6）以步骤（5）所得双链cDNA为底物，进行第一次PCR扩增，得到仅包含mRNA的3’末端相对应的cDNA的初步文库；扩增基于由对应于mRNA近3’端的3’端方向引物和对应于mRNA远3’端的5’端方向引物构成的一对PCR引物进行；其中5’端引物包含批次索引（Index）；引物对与特定二代测序平台相兼容；

（7）对上述文库，进行片段长度选择、富集或回收，和纯化，获得适合于测序平台的长度的文库；

（8）用二代测序平台对步骤（7）所得测序文库测序，以获得混合样品的转录组表达谱；

（9）通过信息分析解码步骤（8）所得转录组表达谱，获得各个批次、和各个样品的转录组表达谱，即得；

其中，所述步骤（2）中的反转录引物包含碱基序列为（NBB）n的分子标记，N表示A/T/C/G四种类型的脱氧核糖核甘酸中的任意一种，B代表T/C/G三种类型的脱氧核糖核甘酸中的任意一种，n代表正整数；所述步骤（4）中的cDNA第二链合成引物的3’末端为1个或2个T。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（6）之后还可包括第二次PCR扩增，以获得适合二代测序的最终测序文库。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，第二次PCR扩增时，采用第一次PCR同样的引物对，包括同样的批次索引（Index）；或者其中的部分序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（6）的PCR扩增引物的碱基序列如SEQ IDNO.11和12所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（1）中的RNA为总RNA，或者是从总DNA分离的mRNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（1）中的样品是直接采用群体细胞、或单个细胞进行管内裂解释放，而不经过前期的RNA纯化、洗脱、回收过程。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（1）中，在获得RNA时，将基因组DNA采用物理方法、化学方法或酶解法剔除。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（2）中反转录引物3’末端带有oligo-dT，长度为6～40个碱基。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述长度为18-24个碱基。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述引物5’端包括测序文库5’接头序列（Adapter）相兼容的序列。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述反转录引物包含转录子水平的独特分子标记（UMI），或/和样品条码（barcode）。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述反转录引物还包含实验批次索引（Index）以及与特定二代测序平台相兼容的测序文库接头序列（Adapter）相兼容的序列。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述3’末端的oligo-dT末端为TnVN-3’ 、TnV-3’、Tn-3’、或TnN-3’，其中n为6～40，V代表C、G或A；N表示A、T、C和G中任意一种。