[发明专利]一种新的RNA高通量测序的方法、引物组和试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了用于高通量构建RNA测序文库的引物组和建库方案及相关试剂盒及其应用；本发明还公开了该文库的构建方法和测序数据的分析方法。用于RNA高通量测序文库构建的引物组，其包括反转录引物，所述反转录引物包含转录子水平的独特分子标记(UMI)，或/和样品条码(barcode)，或/和实验批次索引(Index)以及与特定二代测序平台相兼容的测序文库5’接头序列(Adapter 5’)相兼容的序列。采用本发明的文库构建方法、测序方法和数据分析方法，建库流程简单，操作方便；建库时间显著缩短；能进行较大量样品的高通量操作，建库效率提高；分析过程更简单；建库、测序和分析成本显著降低。

技术领域

本发明涉及RNA高通量测序技术领域，尤其是用于RNA高通量测序的引物组、试剂盒和方法及其应用。

背景技术

转录组测序(RNA-Seq，通常指mRNA-seq)对正常和病理样本提供数字化和可视化转录组图谱，促进了对生命和疾病过程的分子机制的理解，有重要的应用前景，是功能基因组学的关键组成部分。虽然RNA-seq已经从群体细胞测序深入到单细胞水平，但群体细胞RNA测序文库构建仍然具有最广泛的市场，然而目前的测序建库技术步骤繁多、费用昂贵、费时费力、建库和测序成本高。人们期望一种更高效、高通量的简便RNA-seq技术。我们注意到，在RNA测序应用中，多数主要是需要分析基因表达差异，并不需要得到全长转录本的序列；另外，现今文库构建方案中有些步骤其实是多余的。

诞生于20世纪70年代的第一代测序技术(Sanger测序)^[1]，帮助科学家们开始探索基因组信息，在基因组序列的解密上取得了前所未有的重大突破；但是，由于测序的通量低以及费时费力。在这种情况下。高通量测序又称为“下一代测序技术”或“二代测序技术”(Next Generation Sequencing，NGS)应运而生。它能一次并行对百万甚至亿级的DNA分子进行序列测定，具有高效性等特点，推动了人类基因组计划和后基因组计划等重大研究的完成。近年来，高通量测序技术也在逐步地获得更新，并发展到转录组、表观组、蛋白质组及多维组学领域，并得到越来越广泛的关注和应用，使我们能够不仅对一个物种的基因组进行细致全貌的分析，而且也促进了人类健康和疾病的分子机制和调控机制研究以及诊疗的突破性进展。

近年来，测序工业一直由Illumina主导，Illumina采用基于边合成边测序方法，使用荧光标记的可逆终止核苷酸。测序文库中的DNA分子被原位克隆扩增，固定在流动槽(flow cell)的表面上。目前，Illumina HiSeq是RNA-Seq最常用的一种测序平台，并为NGS测序设定了标准。该平台有不同数量的流动槽，每个流动槽提供八个独立的通泳道(lane)，一个lane包含两列，每一列有60个小区(tile)，每个tile会种下不同的簇(cluster)，从而进行测序反应，每个通泳道可以加入多个测序文库。每个文库各有独立的索引(Index)，每个文库可以是一个样品或者是多个样品；如果是多个样品则每个样品还必须相互区分，例如在单细胞测序中用条码(Barcode)。

目前市场上关于从群体细胞样品(即纯化RNA)进行RNA-Seq(这里专指mRNA-seq)的建库试剂盒主要来自于Illumina、NEB、Qiagen以及Invitrogen公司。Illumina、NEB和Qiagen公司现有的mRNA-Seq的建库流程相似，步骤如下：提取总RNA后，使用oligo dT磁珠富集Poly A RNA(mRNA)；然后片段化mRNA，并用随机引物进行反转录；接下来对cDNA片段的3’末端加A以便于连接含有批次索引index和测序引物结合位点“Y”形接头；最后，连接的cDNA被PCR扩增并准备用于测序分子簇生成和测序(如图1A)。Invitrogen的RNA文库制备试剂盒与前三种有部分不同，它的主要步骤如下：提取总RNA后，需要进行rRNA的去除或者mRNA的富集；再进行RNA片段化；之后加入一组DNA/RNA接头混合物，其一端具有单链简并序列，另一端具有确定序列，其简并序列可与片段化RNA结合并将接头带至RNA附近，之后加入连接酶混合物以连接接头；再加入反转录引物合成cDNA第一条链；最后用带有测序平台的引物PCR扩增cDNA用于簇生成和测序(如图1B)。