[发明专利]一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用

说明书

本发明公开了一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用。所述嘌呤核苷磷酸化酶突变体由大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶第167位甲硫氨酸突变成精氨酸、第168位苯丙氨酸突变成丙氨酸所得。本发明利用定点饱和突变技术对大肠杆菌(Escherichia coli)的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)进行催化性能改良，筛选出的PNP突变酶比活力可达310U/mg，较野生型酶提高约47.6％，热稳定性更为优良。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP；EC 2.4.2.1)，可催化可逆的嘌呤核苷的磷酸解反应。主要分成两类：低分子量的同源三聚体类(80-100kDa)；高分子量的同源六聚体类(110-160kDa)。后一类酶因底物特异性较广，在合成应用中尤为重要，特别是在医药领域有着良好的应用价值和前景。

作为单体的核苷类似物已经被广泛应用于癌症和抗病毒治疗。作为抗病毒物质，核苷是通过抑制病毒基因组的复制发挥作用，而作为抗癌化合物则是通过抑制细胞DNA的复制与修复，例如抑制聚合酶活性或者在RNA或DNA合成中充当链终止子。而且，C2’-氟化核苷作为反义寡核苷酸和小干扰RNA的组分效果更好。为了能够设计有效的，具有选择性且无毒副作用的药物，已经设计了各种策略。这些方法涉及到了对天然核苷的修饰，特别是碳水化合物部分的改变。

传统上，2’-氟-2’-脱氧腺苷是通过各种化学方法制备的，但是修饰核苷的化学合成受立体和区域选择性要求的挑战，以及保护和去保护敏感官能团的需要。相比之下，胸腺嘧啶磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP；EC 2.4.2.4)与嘌呤核苷磷酸化酶可用作生物催化剂，在环境友好条件下有效合成核苷类似物更具有优势，但野生型嘌呤核苷磷酸化酶的活性较低，不够满足生产需求。

公开号为CN101629169A的发明专利申请公开了一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。采用PCR技术从嗜热乳链球菌(Streptococcus thermophilus)中扩增嘌呤核苷磷酸化酶全长片段，用pET-43.1b(+)质粒构建pET-43.1b(+)-PNP重组载体，用定点突变的方法将片段第230位半胱氨酸突变为丙氨酸，用Escherichia coli BL21(DE3)转化为工程菌，获得的突变酶可提高热稳定性。

公开号为CN103468656A的发明专利申请公开了一种突变的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr，突变酶的最高比活性达到45U/mg。

就工业化应用而言，嘌呤核苷磷酸化酶的催化性能仍不能达到需求。

发明内容

本发明针对现有技术中嘌呤核苷磷酸化酶的热稳定性较差、活性较差的问题，提供了一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用，该嘌呤核苷磷酸化酶突变体具有更高的酶活及更好的热稳定性。

一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，由大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶第167位甲硫氨酸突变成精氨酸、第168位苯丙氨酸突变成丙氨酸所得。优选的，所述的嘌呤核苷磷酸化酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明又提供了编码所述嘌呤核苷磷酸化酶突变体的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组表达载体。重组表达载体的骨架质粒选择可以是任何能够在插入了所述基因后表达出对应嘌呤核苷磷酸化酶突变体的质粒。优选的，所述的重组表达载体，由所述基因插入到PET-28a(+)质粒所得。