[发明专利]一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法

说明书

本发明提供了一种超高效液相色谱‑串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，属于分析化学技术领域。样品经甲酸/乙腈（10:90）提取，加入QuEChERS盐包振摇离心，提取液过OASIS PRIME HLB小柱和Dspe净化管处理，以Waters HSS T₃色谱柱分离，采用正负离子同时扫描的多反应离子监测（MRM）模式，茶叶基质匹配标准溶液，同位素内标法定量。本方法稳定、准确、灵敏、快速，能够满足各种茶叶中多种毒素残留分析的需求。

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素(mycotoxins)是某些真菌在一定环境条件下产生的，危害人和动物的次级毒性代谢产物。迄今发现超过400种真菌毒素，主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、单端孢霉烯族毒素中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、杂色曲霉素、桔青霉素等。这些毒素经口或皮肤吸入对人和动物具有急性毒性，还可作用于肝脏、肾脏、神经系统、内分泌系统和免疫系统，具有致畸、致癌、致突变、中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等慢性毒性。中国是茶叶的生产、出口和消费大国，关于茶叶尤其普洱茶、茯砖茶等发酵茶中真菌毒素污染已引起消费者的关注。虽然茶叶加工过程干燥环节可能杀灭茶中的大多数微生物，但若包装、贮藏不当，尤其茶叶吸湿受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。已有报道检出茶叶污染黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、赭曲霉毒素、T-2毒素等真菌毒素。陈年老茶亦称年份茶，是指存储一段时间后具有保健功能的茶叶，由于其需要存储过程较长，存储不当将有可能导致茶叶发霉变质，产生毒素。目前国内外对一些茶叶中有关的黄曲霉菌B₁、赭曲霉菌A等单一真菌毒素污染情况的检测分析较多，但是缺乏对茶叶中10种或10以上真菌毒素同时检测的研究。因此有必要建立一种同时检测茶叶中多种真菌毒素的方法。

目前，茶叶中真菌毒素的检测方法主要包括薄层色谱法、酶联免疫法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法等。其中，酶联免疫法容易出现假阳性，只能作为筛查方法；高效液相色谱法需要柱前或柱后衍生，柱前衍生形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难，在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品损失，柱后衍生对于一定的溶剂和有限的反应时间来说，所供选择的反应条件有限，容易造成反应不充分，或者反应副产物过多，而且柱后衍生需要额外的设备，反应器可造成峰展宽，降低分辨率，最终不但会影响定量结果，而且会对仪器带来污染；液相色谱-串联质谱联用技术与其它方法相比，定量更加准确，选择性和灵敏度也更高，已逐渐取代传统的液相色谱方法应用于茶叶中真菌毒素的检测。目前采用液相色谱-串联质谱联用技术检测茶叶毒素的前处理步骤比较复杂，需要使用到多功能进化柱、免疫亲和柱进行对提取液进行净化。国标中涉及的样品类型基质比较简单，通过两次净化基本能去除杂质。但对于基质复杂的茶叶而言，简单的两次净化，是很难去除杂质，而杂质过多将导致质谱分析时基质效应明显，最终定量不准确。因此必须采用更高效的方法对样品提取液进行净化。

不同真菌毒素对溶剂要求不一，例如黄曲霉毒素不溶于水，一些含羧基基团毒素如伏马毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集团毒素需要偏酸环境下进行提取。同时，有些提取溶剂更容易将茶叶中一些酸、醇、酚类等杂质提取到提取液中，而有些溶剂提取则提取液中杂质较少，因此选择最佳的提取溶剂对后续净化、检测以及样品回收率等均有很大的影响。

采用液相色谱-串联质谱联用技术检测毒素过程中，流动相的选择影响到检测物的峰型、检测所需的时间等，因此，建立一种较好的流动相和梯度洗脱程序，可提高检测的灵敏度和减少检测时间，从而提高检测效率。

目前国内外对茶叶中多种真菌毒素的检测方法不稳定，灵敏度低，只能同时检测一种或几种毒素，检测效率低，未见同时检测10种以上真菌毒素，且不能同时检测不同品种茶即不同程度发酵茶中的多种真菌毒素。本发明即针对上述的高效提取溶剂、净化环节和高效的流动相洗脱梯度程序等3个问题而研究提出。

发明内容