[发明专利]一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法

权利要求书

1.一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析。

2.根据权利要求1所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，包括如下步骤：

步骤S1样品预处理，取待检测细胞样品，提取细胞样品中的蛋白，作为蛋白样品，向提取出的蛋白样品中添加裂解液，混匀使蛋白变性，将变性蛋白样品溶剂置换为反应缓冲液，换溶剂后的蛋白样品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物，样品在冰面上放置，从置换溶剂后的蛋白样品溶液中取出两份样品分别进行步骤S2和步骤S3。

步骤S2，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl₂溶液，混匀，将1mM的ATP探针溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂，再取出树脂使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品，提取出的蛋白样品再进行FASP酶解，酶解后的样品进行脱盐处理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；

步骤S3，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl₂溶液，混匀，将1mM的ATP探针溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液，再加入500mM二硫苏糖醇，37℃孵育20-40min，加入1M的碘乙酰胺，黑暗反应30min，再将样品溶剂替换为含有20mM的三(羟甲基)氨基甲烷的2M尿素溶液，再向样品中加入胰蛋白酶酶解12-24h，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用IP裂解液处理树脂，再采用PBS溶液清洗树脂，再使用含有0.1％的三氟乙酸的50％乙腈溶液对树脂进行洗脱，将洗脱液冷冻干燥，用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；

步骤S4，将步骤S2和步骤S3获得的样品分别进行高效液相色谱-串联质谱分析。

3.根据权利要求2所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，所述的步骤S1中的裂解液添加量为体积比1：2＝蛋白样品溶液：裂解液；所述的蛋白样品液置换溶剂具体为通过7KDa的Zeba脱盐离心柱进行溶剂置换。

4.根据权利要求2所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，所述的步骤S1中提取出蛋白样品后和蛋白样品液置换溶剂后使用BCA定量法对蛋白进行定量，同时将置换溶剂后的蛋白样品溶液稀释到2mg/ml，再取出步骤S2和步骤S3的样品。

5.根据权利要求2所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，所述的步骤S2和S3中的MgCl₂的用量为10μl，所述的ATP探针的用量为10μl；所述的步骤S2和S3中的尿素/IP混合裂解液的用量为500μl；所述的步骤S2和S3中的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂的用量为50μl；所述的步骤S2和步骤S3中孵育后提取树脂的离心条件为1000g离心1min；所述的步骤S2中使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂为向样品中加入500μl尿素/IP混合裂解液，混匀，1000g离心1min；所述的步骤S2中的使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品为加入50μl的SDT缓冲液，沸水浴5min，1000g离心1min；所述的步骤S2中酶解后的样品采用MCX萃取柱进行脱盐。