[发明专利]一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法

说明书

一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱‑串联质谱分析，具有蛋白激酶检测率高、灵敏度高，同时为激酶定性定量研究提供新的实验方法。

技术领域

本发明涉及生物监测技术领域，具体涉及一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法。

背景技术

蛋白激酶可以催化蛋白发生磷酸化反应，从而调节细胞很多生理功能，比如信号转导、代谢调控、DNA损伤修复等，其异常表达与很多疾病比如肿瘤、糖尿病和老年痴呆等密切相关。目前蛋白激酶数量大约有518种，是非常重要的药物靶点，也是目前药物研究的热点。国内外科研院所及医药企事业单位的激酶组研究市场需求比较大，因此，激酶富集和质谱定性定量技术具有重要意义。

但是目前的蛋白激酶检测分析方法中，常常由于蛋白激酶的含量不足造成检测灵敏度低、速度慢和经常漏检的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析，具有蛋白激酶检测率高、灵敏度高，同时为激酶定性定量研究提供新的实验方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析。

根据以上方案，所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，包括如下步骤：

步骤S1样品预处理，取待检测细胞样品，提取细胞样品中的蛋白，作为蛋白样品，向提取出的蛋白样品中添加裂解液(Lysis buffer)，混匀使蛋白变性，将变性蛋白样品溶剂置换为反应缓冲液(Reaction Buffer)，换溶剂后的蛋白样品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail(100X)(1:100稀释))，样品在冰面上放置，从置换溶剂后的蛋白样品溶液中取出两份样品分别进行步骤S2和步骤S3。

步骤S2，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl₂溶液，混匀，将1mM的ATP探针(desthiobitin-ATP)溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液(Urea/IP Lysis buffer)，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂(High Capacity Stretavidin Agarose Resin)，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂，再取出树脂使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品，提取出的蛋白样品再进行FASP酶解，酶解后的样品进行脱盐处理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；