[发明专利]一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法

权利要求书

1.一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，从待检测细胞中提取外泌体样品；

步骤S2，向步骤S1中获得的外泌体样品中添加同位素内标的外泌体脂质标准品，涡旋混合，加入预冷的甲醇，涡旋混合，再加入甲基叔丁基醚，涡旋混合，室温静置，离心取上层有机相，干燥后用异丙醇/乙腈混合液复溶，离心取上清液，备用；

步骤S3，取步骤S2最后获得的样品上清液进行液相色谱分析，色谱条件为，4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为300μL/min，进样量2μL。液相梯度如下：0-2min，B液维持在30％；2-25min，B液从30％线性变化至100％；25-35min，B液维持在30％；A液为10mM甲酸铵乙腈水溶液；B液为10mM甲酸铵；

步骤S4，步骤S3中经液相色谱分离的样品直接进行质谱分析，质谱条件：ESI源，正离子模式，加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb，喷雾电压：3.0KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：50％，一级扫描范围:200-1800；

负离子模式：加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb,喷雾电压：2.5KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：60％，一级扫描范围:250-1800。

2.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中提取外泌体的过程具体是，取细胞上清液样品，800g，离心15min；取上清液再2,000g，离心30min；取上清液再7,500g，离心30min；取上清液过0.22μm滤膜，取滤液100,000g离心2h，去除上清液，加入PBS重悬，再以100,000g离心2h，去除上清液，再次加入PBS重悬，得外泌体样品。

3.根据权利要求2所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的离心均为在4℃的环境下离心。

4.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中预冷甲醇是预先冷冻到4℃的甲醇；所述的步骤S2中室温静置的时间为20-40min；所述的步骤S2中的离心条件是10℃下14000g离心15min；所述的步骤S2中的干燥为用氮气吹干；所述的步骤S2中的异丙醇/乙腈混合液为体积比异丙醇：乙腈＝9：1的混合液。

5.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的同位素内标的外泌体脂质标准品包括PC、PE、PS、PG、PI、PA、LPC、LPE、CholEster、MG、DG、TG、SM、Cholesterol和Ceramide。

6.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的A液的乙腈水溶液是体积比为乙腈：水＝6:4的乙腈水溶液；所述的步骤S3中的B液的乙腈异丙醇溶液是体积比为乙腈:异丙醇＝1:9的乙腈异丙醇溶液。