[发明专利]一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法

说明书

本发明提供一种基于LC‑MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，采用差速离心富集外泌体配合内标法定量测量，再结合优化的液相色谱和质谱的分析参数，在待测物中加入多种类别的稳定同位素内标物质，能够有效减少离子抑制作用带来的定量影响，对细胞外泌体样本进行高覆盖度的脂质组学得到绝对定量分析，具有更好的稳定性，且能够极大的提升定量的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法。

背景技术

外泌体是由细胞主动向外分泌的双层囊小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程，如递呈抗原、促进肿瘤生长与迁移、修复损伤组织等。脂质是细胞膜的重要组成部分，在细胞的信号传导、物质运输、能量储存等方面发挥重要作用。脂质的代谢异常与外泌体携带运输脂质过程密不可分。因此，建立可靠、稳定、高覆盖的外泌体脂质代谢分析方法对研究外泌体相关的多种疾病的发生、发展机理及药物疗效的评价具有积极的指导意义。

目前还未有针对外泌体脂质组学绝对定量的研究报道。非靶向脂质组学分析是基于质谱技术的一种常用的脂质分析方法，利用高分辨质谱的全扫描模式及数据依赖模式的二级离子扫描对待测样品分析，再利用软件对采集的全扫描谱图进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)，保留时间及强度等信息的峰表，再利用商业化的脂质定性软件对采集的二级谱图进行定性。该方法存在一定的局限性：由于同时进行检测的离子过多，离子抑制严重，使得质谱的线性响应较差，无法通过常规标准曲线法对待测物进行绝对定量分析，仅能通过各待测物的质谱响应强度给出一个相对的定量结果，定量的准确性较差，往往会得到错误的结果。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，采用差速离心富集外泌体配合内标法定量测量，再结合优化的液相色谱和质谱的分析参数，在待测物中加入多种类别的稳定同位素内标物质，能够有效减少离子抑制作用带来的定量影响，对细胞外泌体样本进行高覆盖度的脂质组学得到绝对定量分析，具有更好的稳定性，且能够极大的提升定量的准确性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，包括如下步骤：

步骤S1，从待检测细胞中提取外泌体样品；

步骤S2，向步骤S1中获得的外泌体样品中添加同位素内标的外泌体脂质标准品，涡旋混合，加入预冷的甲醇，涡旋混合，再加入甲基叔丁基醚，涡旋混合，室温静置，离心取上层有机相，干燥后用异丙醇/乙腈混合液复溶，离心取上清液，备用；

步骤S3，取步骤S2最后获得的样品上清液进行液相色谱分析，色谱条件为，4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为300μL/min，进样量2μL。液相梯度如下：0-2min，B液维持在30％；2-25min，B液从30％线性变化至100％；25-35min，B液维持在30％；A液为10mM甲酸铵乙腈水溶液；B液为10mM甲酸铵；

步骤S4，步骤S3中经液相色谱分离的样品直接进行质谱分析，质谱条件：ESI源，正离子模式，加热温度(Heater Temp)：300℃,鞘气流速(Sheath Gas Flow rate)：45arb,辅助气流速(Aux Gas Flow Rate)：15arb,吹扫气流速(Sweep Gas Flow Rate)：1arb，喷雾电压(I spray voltage)：3.0KV,离子传输管的温度(Capillary Temp)：350℃,透镜电压(S-Lens RF Level)：50％，一级扫描范围(MS1 scan ranges):200-1800；