[发明专利]一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法

权利要求书

1.一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液；

步骤S2，采用空白基质配制靶向血管内皮生长因子的康柏西普蛋白溶液，作为内标工作溶液；

步骤S3，分别取相同体积的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白基质加入与内标工作液体积相同的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入生物素化的血管内皮生长因子和磷酸缓冲盐溶液，摇晃孵育；

步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入带有亲和素的磁珠，室温孵育富集；

步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入胰蛋白酶进行酶解；

步骤S6，采用固相萃取板纯化步骤S5获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品；

步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析贝伐珠单抗。

2.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.15μg/mL-15μg/mL。

3.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S2中的内标工作溶液的浓度为10μg/mL。

4.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S3中的摇晃孵育是25℃，800rpm摇晃孵育1h。

5.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S4中的室温孵育时间为30min，孵育完成后使用含有0.1％的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液清洗孵育完的磁珠，并去掉清洗液。

6.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S5中的酶解具体过程是，分别加入1％的RapiGest SF溶液、100mM的二硫苏糖醇和50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，95℃反应5min；再加入200mM碘乙酰胺，避光反应30min，12000rpm 4℃离心5min并取上清夜，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件是37℃酶解16h，加入0.5％的甲酸终止酶解反应。

7.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S6的纯化具体是，分别用甲醇和超纯水活化平和固相萃取板，将酶解后的各样品上样，再分别用2％FA水溶液和5％甲醇淋洗，最后用含2％氨水和40％乙腈的水溶液洗脱样品。

8.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S7的质谱分析中设置贝伐珠单抗的特征性肽段为FTFSLDTSK；康柏西普蛋白的特征性肽段为ELVIPCR。