[发明专利]一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法

说明书

本发明的目的是提供一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，采用抗原血管内皮生长因子(VEGF)亲和富集生物样品中的贝伐珠单抗，酶解获得特征性肽段，通过定量特征性肽段从而定量生物样品中贝伐珠单抗的含量，具有特异性高、高通量和灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法。

背景技术

单克隆抗体药物具有特异性高、靶向性强、半衰期长和毒副作用低等特点，是全球生物制药市场与研发中最重要的品类之一，已成功应用于癌症、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。贝伐珠单抗是一种靶向血管内皮生长因子(VEGF)的重组人源化单克隆抗体，应用于癌症的临床治疗，是全球畅销前十的药物之一。建立规范可靠的生物分析方法对单克隆抗体药物及其生物类似药的药代动力学研究具有重要的意义。目前，蛋白类药物生物样品分析方法包括酶联免疫吸附方法(ELISA)和质谱法，其中ELISA是主要采用的分析方法。ELISA法具有灵敏度高、通量大等优点，但特异性低、易受内源性物质干扰，影响定量的可靠性；而质谱法特异性高，但灵敏度低，故而需要一种新的贝伐珠单抗生物分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，采用抗原血管内皮生长因子(VEGF)亲和富集生物样品中的贝伐珠单抗，酶解获得特征性肽段，通过定量特征性肽段从而定量生物样品中贝伐珠单抗的含量，具有特异性高、高通量和灵敏度高的优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，包括如下步骤：

步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液；

步骤S2，采用空白基质配制靶向血管内皮生长因子(VEGF)的康柏西普蛋白溶液，作为内标工作溶液；

步骤S3，分别取相同体积的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白基质加入与内标工作液体积相同的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入生物素化的血管内皮生长因子(VEGF)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，摇晃孵育；

步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入带有亲和素的磁珠，室温孵育富集；

步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入胰蛋白酶进行酶解；

步骤S6，采用固相萃取板(SPE板)纯化步骤S5获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品；

步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析贝伐珠单抗。

根据以上方案，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.15μg/mL-15μg/mL。

根据以上方案，所述的步骤S2中的内标工作溶液的浓度为10μg/mL。

根据以上方案，所述的步骤S3中的摇晃孵育是25℃，800rpm摇晃孵育1h。

根据以上方案，所述的步骤S4中的室温孵育时间为30min，孵育完成后使用含有0.1％的牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗孵育完的磁珠，并去掉清洗液。