[发明专利]合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌为合成底盘，将海藻糖合成酶基因构成表面展示基因表达盒并转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母，构成重组解脂耶氏酵母菌。然后以该重组酵母菌先发酵葡萄糖生成赤藓糖醇，分离酵母细胞用作全细胞催化剂一步转化麦芽糖生成海藻糖。转化结束后在转化液中加入氮源和无机盐，接种酿酒酵母分解转化液中的杂质得到高纯度海藻糖。由于该方法采用酵母全细胞转化，相对于破细胞纯化酶等工艺，不但减少了步骤，而且无酶制备成本。

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法；具体是利用解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶一步转化麦芽糖合成海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两分子α-葡萄糖通过α-1，1糖苷键连接，属于非还原性二糖(non-reducing disaccharide)，最早在十九世纪早期从黑麦麦角中发现的，后来在各种动植物，微生物细胞中均发现海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脱水的细胞中含量丰富。比如，在干燥的复活草(如鳞片卷柏Selaginella lepidophylla)、休眠的线虫(nematodes)、脱水面包酵母(baker’s yeast)、干燥的地衣植物中含量丰富(Elbein etal.New insights on trehalose:a multifunctional molecule.Glycobiology,13:17-27)，这些生物细胞中失去99％的水分仍能生存若干年，而当有水存在时能迅速恢复细胞活力。在脱水面包酵母中，海藻糖的含量占据细胞干重的10～15％左右。

海藻糖在细胞中的存在，除了作为能源储存外，更多的作为抵御外界不良环境的保护剂(protectant)，使得细胞中的大分子(如酶)在极端条件下(如高温、低pH、干燥、冷冻等)仍然具有活性，能维持细胞质中大分子的结构以及维持细胞膜的完整性(Ohtani andUsui.1994.Production of trehalose by fermentation and its application.FoodChem,2:91-95；Singer and Nas-Lindquist.1998.Multiple effects of trehalose onprotein folding in vitro and in vivo.Mol Cell,1:639-648)。由于没有还原基团，海藻糖与富含氨基酸的食品配料混合后在高温下不会发生美拉德反应，能良好的保持食品的风味。海藻糖还具有良好的持水性，能与失水细胞中残余的水牢固结合保护生物大分子的结构完整性(Belton and Gil.1994.IR and Raman spectroscopics studies of theinteraction of trehalose with hen egg white lysozyme.Biopolymers,34:957-961)。

由于海藻糖具有上述优良的生理生化特性，其在医药领域、食品领域以及化妆品领域都得到十分广泛的应用。

在医药领域常用于疫苗、血液制品、抗体的稳定剂，使疫苗在常温下以及冷冻的条件下同样具有稳定性，增加血液制品以及抗体在冷冻条件下的稳定性(Patent WO1996/022107)。海藻糖还可以和透明质酸配伍用于制备眼部用药传递系统以及润滑剂(中国发明专利200410036422.0，200410075549.3)，还可以制成关节腔内注射药剂，起到抗氧化和抗自由基的作用，改善炎症症状，为软骨修复提供所需要的糖分，加速软骨的修复(中国发明专利200610103472.5)。同时海藻糖还可以进行衍生化合成其它的药物，在防止肿瘤的侵袭以及转移具有显著的效果(中国发明专利201010246792.2，201110150999.4)。海藻糖的衍生物还可以用于制备皮肤外用剂，具有促进血液循环，保湿，吸收紫外线以及抗氧化的功效(Patent WO2004/071472,JP2004/001401)。