[发明专利]一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。本发明根据新型冠状病毒2019‑nCoV的ORF1ab基因、E基因、N基因、S基因和M基因设计特异性引物和探针，用于新冠病毒的鉴别检测。本发明检测2019‑nCoV的特异性引物/探针和试剂盒，灵敏度、精密度、准确度高，特异性好，稳定性好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现。具有较高的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，更具体地，涉及一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

核酸检验（RT-PCR）是新冠肺炎诊断的“金标准”。国家药品监督管理局应急审批首批7家企业的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒【一文读懂新型冠状病毒的核酸检测,国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心,中国医药报,2020-2-11第002版】，批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（Openreading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）三个基因设计。

但病毒的进化非常迅速【Bartoszewicz J M, Seidel A, Renard B Y.Interpretable detection of novel human viruses from genome sequencing data[J]. BioRxiv, 2020.】，通过对序列的比对和文献检索，可以发现，ORF1ab基因已经发现相关SNP位点突变，编码结构蛋白的基因（如，S、E、M和N）在β冠状病毒属中表现高度保守性，但E基因与蝙蝠物种高度同源，针对E基因的引物探针很难或不能与这两个物种进行区分。

中国科学院主办的《国家科学评论》（National Science Review）于3月3日发表论文《关于SARS-CoV-2的起源和持续进化》（On the origin and continuing evolution ofSARS-CoV-2），中国科研团队最新发现显示：新冠病毒已于近期产生了149个突变点。一份发表在病毒学国际交流平台，由巴西Adolfo Lutz国家研究所、国家参考实验室，以及圣保罗大学、牛津大学热带医学研究所共同完成的题为《First report of COVID-19 in SouthAmerica》的研究首次分析了南美洲新冠病毒的基因序列，初步的遗传分析表明，这株巴西“Brazil/SPBR1/2020”病毒的基因组，跟中国此前公布的“Hu-1参考株”有3处不同，表示病毒在传播的过程中已经开始突变。

因此，目前核酸检测在应用中准确性遭到质疑。一些流行病学史、临床症状吻合，甚至CT显示肺部病毒感染的病患未能得到核酸“阳性”确诊。有学者认为现有核酸检测对于阳性病人，最高30～50%的阳性率。新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南中推荐检测ORF1ab和N基因，检测阳性判断要求两个基因均为阳性；在检测方法的局限性中强调不能排除因病毒变异导致的假阴性可能。Ai J W【Ai J W, Zhang H C, Xu T, et al.Optimizing diagnostic strategy for novel coronavirus pneumonia, a mµlti-center study in Eastern China[J]. medRxiv, 2020.】认为RT-PCR有15%假阴性率，建议设计RT-PCR时建议扩增超过1个基因靶标分析。

综上，在新冠疫情全面爆发的当下，亟需一种特异性强、准确率高用于检测新型冠状病毒的寡核苷酸组合物及其检测试剂盒和应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，该试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；