[发明专利]一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法

说明书

本申请公开了一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法，其特征在于，通过将编码信号肽、化学法切割位点和目的蛋白的基因构建到表达载体中，使得目的蛋白表达后定位到细胞的表面；在收集的细胞中加入含有切割试剂的缓冲液重悬，离心后的上清即为目的蛋白溶液。本申请的蛋白质简易纯化方法利用信号肽的定位功能，使重组蛋白在细胞内表达后分泌并定位到细胞的表面。并利用重组蛋白中间化学剪切位点的优势，只需在用于重悬细胞的缓冲液中加入切割试剂，经过离心就可以非常简便的获取高纯度的目的蛋白。解决了现有技术中纯化蛋白需要裂解细胞以及使用各种性质的层析柱才能获取目的蛋白的繁琐步骤，操作简单，大大节省时间和成本。

技术领域

本申请属于蛋白分离与纯化领域，涉及一种利用将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白的方法。通过将编码信号肽、化学法切割位点和目的蛋白的融合基因构建到表达载体中，使得目的蛋白表达后定位到细胞的外膜。利用这种方法表达的重组蛋白，只需要在收集的细胞中加入含有切割试剂的缓冲液重悬，无需裂解细胞和经过色谱柱纯化，经过离心即可一步获取高纯度、高产量的目的蛋白。

背景技术

重组蛋白的表达系统可分为原核，哺乳动物，酵母和昆虫四类表达系统。重组蛋白在细胞中表达部位可分为细胞质中(胞内)、细胞周质(革兰氏阴性菌，如大肠杆菌)和细胞外。胞内表达是重组蛋白在各种系统中主要的表达形式，已经成功的应用在在工业和科学研究中。要研究某一个具体的蛋白质，首先就需要将这个蛋白从生物体分离纯化出来。但是由于细胞质中蛋白质本底表达较高和种类多，因此要从细胞裂解液的全部组分中分离目标蛋白，同时仍然保留蛋白的生物活性及化学完整性是一项艰巨而繁琐的任务。需要根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法来提高目标蛋白的纯度。

胞内的蛋白质纯化可分为粗分离和精细分离两个阶段。粗分离主要是根据蛋白质间的相似性将蛋白和细胞的非蛋白成分如细胞壁、RNA、DNA等分开。精细纯化阶段的目的是根据蛋白质之间的差异性，把目标蛋白与其他蛋白质分离开，常用的方法有凝胶层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等(S，Nordlund P，Weigelt J，et al.Proteinproduction and purification.Nature Methods，2008，5(2)：135-146.)。由于胞内性质相似的蛋白很多，所以要获取纯度较高的蛋白质往往需要多种纯化方法联用，步骤繁琐，周期较长，成本较高。此外，由于大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于二硫键的形成，导致蛋白不能准确折叠，降低蛋白活性(F J M，Summers D K，Monteiro GA.Recombinant protein secretion in Escherichia coli.Biotechnology Advances，2005，23(3)：177-202.)。细胞质中的蛋白酶活性较高，会降解表达的目标蛋白质(Mergulhao F J M，Monteiro G A，Cabral J M S，et al.Design of bacterial vectorsystems for the production of recombinant proteins in Escherichiacoli.Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，14(1)：1-14.)。