[发明专利]马铃薯黑痣病菌快速检测体系的建立及其应用

权利要求书

1.用于检测立枯丝核菌AG-3融合群的引物对，为如下任一：

(a1)由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对；

(a2)由将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。

2.用于检测立枯丝核菌AG-3融合群的试剂，包括权利要求1所述的引物对、SYBR GreenI实时荧光定量PCR扩增缓冲液和dd H₂O。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增缓冲液，包括dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I、Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中还含有参比染料；

具体的，所述参比染料为ROX参比染料。

5.用于检测立枯丝核菌AG-3融合群的试剂盒，含有下述(b1)和(b2)：

(b1)立枯丝核菌AG-3融合群阳性质粒；

(b2)权利要求1所述引物对或权利要求2-4中任一所述的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述立枯丝核菌AG-3融合群阳性质粒为含有SEQ ID No.3所示DNA片段的质粒。

7.一种检测待测样本中是否含有立枯丝核菌AG-3融合群的方法，为如下(c1)或(c2)：

(c1)包括如下步骤：从待测样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；然后按照如下确定所述待测样本中是否含有立枯丝核菌AG-3融合群：如果所述扩增产物中含有191bp的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有立枯丝核菌AG-3融合群；如果所述扩增产物中不含有191bp的DNA片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有立枯丝核菌AG-3融合群；

(c2)包括如下步骤：从待测样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR扩增；然后根据扩增曲线按照如下确定所述待测样本中是否含有立枯丝核菌AG-3融合群：如果所得扩增曲线为S型或J型曲线，则所述待测样本中含有或候选含有立枯丝核菌AG-3融合群；如果所得扩增曲线为一条直线，则所述待测样本中不含有或候选不含有立枯丝核菌AG-3融合群。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述191bp的DNA片段为SEQ ID No.3所示DNA片段。

9.一种检测待测土壤中立枯丝核菌AG-3融合群的菌核密度的方法，包括如下步骤：

(d1)将系列已知质量的立枯丝核菌AG-3融合群的菌核与土壤混合，得到系列立枯丝核菌AG-3融合群的菌核密度已知的土壤样本，以从各土壤样本中提取的总DNA分别作为模板，以权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，绘制荧光定量PCR标准曲线；

(d2)从待测土壤样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR扩增；然后根据步骤(d1)所绘制的荧光定量PCR标准曲线得出所述待测土壤样本中立枯丝核菌AG-3融合群的菌核密度。

10.如下任一应用：

(e1)权利要求1所述的引物对在制备权利要求2-4中任一所述试剂或权利要求5或6所述试剂盒中的应用；

(e2)权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的试剂或权利要求5或6所述的试剂盒在检测立枯丝核菌AG-3融合群中的应用，或者在制备用于检测立枯丝核菌AG-3融合群的产品中的应用；

(e3)权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的试剂或权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7-9中任一所述的方法在对马铃薯黑痣病进行早期预测预报中的应用。