[发明专利]一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用

说明书

本发明提供了一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，所述慢病毒载体包括P2A‑T2A连接肽连接的经优化的多个珠蛋白基因，在蛋白质水平上实现了珠蛋白的高效表达，载体的长度得到实质性缩减，显著提高了慢病毒包装效率，降低了生产工艺的复杂程度和质控要求，从根本上解决了珠蛋白慢病毒载体的低效高能耗的缺陷，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，尤其涉及一种HBB和HBG2双表达慢病毒载体及其应用。

背景技术

当前国际上正在开展的地中海贫血基因治疗试验主要由BlueBird公司领衔，该公司以BB305载体为骨架生产的慢病毒药物LentiGlobin已经进入II期和III期临床试验阶段，结果振奋人心，HGB-204和HGB-205等对地中海贫血具有显著的治疗效果。其主要治疗方案流程为：首先采集患者自体造血干细胞，经体外慢病毒感染后，将整合有正确珠蛋白表达模块的造血干细胞回输到患者体内，经稳定造血重建后即可恢复HBB珠蛋白基因的表达。

然而，慢病毒载体携带的珠蛋白表达模块必须包含4～5个长片段顺式调控元件，才能维持RNA水平的高效转录；由此导致转录组长度达7～8kb，接近慢病毒包装极限，导致病毒效价低，包装批次不稳定，生产成本高。近期，BlueBird公司宣布因生产工艺的调整，LentiGlobin的上市时间会有延后，随后又宣布解决了生产工艺问题，可以按期上市。可见，载体的大负荷显著影响了药物的生产，药物的稳定性和转导效率也受到很大影响。

CN110106203A公开了一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用，所述HBB过表达载体包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNase I核心高敏位点、启动子、HBB表达框和下游高敏位点；所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3、HS2和3’E等；所述HBB表达模块的总长度小于4kb。本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，不仅显著缩短了HBB表达模块的长度，而且提高了HBB表达模块的转录激活强度，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活。然而，客观上载体的长度处于有限的缩短，没有发生质的改变。

因此，进一步缩短珠蛋白表达模块的长度，对于地中海贫血的基因治疗具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，在不降低珠蛋白表达水平的基础上，从根本上缩短了珠蛋白表达模块的长度，极大缩短了慢病毒的包装长度，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种连接肽基因，所述连接肽基因包括串联的P2A和T2A；

所述连接肽基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

SEQ ID NO:1：

GATATCggatctggaGCCACCAACTTCTCTCTCCTGAAACAGGCTGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCAGGGCCCggatctggaGAGGGAAGGGGATCTCTCCTGACCTGCGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCACCCGGGaccATGacc。

本发明中，将两个2A序列porcine teschovirus-1(P2A)和Thosea asigna virus(T2A)相串联，得到的连接肽有利于实现对串联的多肽的完美切割分离，性能优于单独的2A序列；本发明根据HBB表达框和HBG2表达框，对P2A-T2A进行序列优化，在保证P2A-T2A可以正常翻译的情况下，实现了HBB和HBG2两个多肽的彻底分离。

第二方面，本发明提供了一种融合基因，所述融合基因包括如第一方面所述的连接肽基因。