[发明专利]多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用

说明书

本发明公开了一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQ ID NO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359‑360位间插入碱基A，第377‑760位384bp替换为A，碱基序列如SEQ ID NO.2。本发明通过CRISPR/Cas9多基因技术成功获得了多基因突变体，所述多基因突变体与野生型早稻相比，穗数和千粒重增加，株高降低，显著提高了早稻的产量，而且抗倒伏，在早稻育种中有很大的应用价值。

技术领域

本发明涉及转基因旱稻领域，尤其涉及多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用。

背景技术

水稻是我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40％。然而水稻需水量大，约占农业用水的70％。我国地域广阔，水资源分布不均，西北地区长期缺水、华北地区旱灾频繁、云南西南部高寒贫困山区及半山区地形地势复杂，雨量分布在季节上不平衡，旱灾在长江流域和华南稻区也频繁发生，一旦干旱发生，水稻往往大幅减产。随着工业和城市用水及其它农业用水的迅猛增长也使水稻灌溉越来越难以保证，干旱缺水与水稻用水的供需矛盾日益严重，发展节水农业已经迫在眉睫。

旱稻(陆稻)品种较水稻品种具有较强的节水抗旱性能，其种植管理方式与小麦相似，耗水量仅是水稻的1/5～1/3。此外旱稻还具有耐瘠、适应性广等特点。但是相比于水稻，旱稻产量普遍较低且品质较差。因此培育优质高产旱稻新品种，发展旱稻旱作生产可以改变传统稻作生产栽培耕作方式、节约淡水资源，是实现稻谷可持续生产的新革命。

云南省农业科学院粮作所选育的旱稻新品种陆引46，2017年8月18日通过越南农业与农村发展部审定。陆引46系籼型旱稻，是云南省旱稻主栽品种。该品种表现为株型紧凑、分蘖力旺盛，同杂草竞争力强，兼顾了多穗型和大穗型的特点，抗稻瘟病，生育期适中，米质中上，但是产量优势不明显，故本发明旨在通过基因编辑手段提高旱稻的产量。

发明内容

本发明提供一种多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用，利用CRISPR/cas9多基因敲除的方法同时对旱稻中限制产量的多个关键基因进行基因敲除，获得提高旱稻产量的多基因敲除突变体。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQ IDNO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359-360位间插入碱基A，第377-760位384bp替换为A，碱基序列如SEQ ID NO.2。

作为优选，所述旱稻为籼系旱稻，尤其适用于旱稻陆引46。

进一步地，用于检测多基因敲除突变体的引物如下：

GW2-F：AAAAGGGATATGCACCG；

GW2-R：CCAGGCTACAATGACACC；

SD1-F：TCTCATCTCCAATCTCATGGTGGCC；

SD1-R：CAGGTCGGTTTCTTCCCGCTTTC。

进一步地，多基因敲除突变体通过以下方法获得：利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将多靶点表达载体转化旱稻愈伤组织，对以下靶点基因组合进行定点敲除，获得基因GW2和SD1同时编辑的多基因敲除突变体；

所述靶点基因组合如下：基因GW2和基因SD1；或基因GW2、基因SD1和基因DEP1；或基因GW2、基因SD1和基因GS3；或基因GW2、基因SD1、基因DEP1和基因GS3。

本发明对DEP1，GS3，GW2和SD1中的2～4个基因进行同时敲除，获得数个基因敲除的突变体，通过培育发现本发明提供的双基因突变体能显著提高产量，而且能够抗倒伏。