[发明专利]一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用

说明书

本发明提供一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用，属于生物技术领域。该方法，包括培养敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株的步骤。本发明还提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。采用本发明方法，大肠杆菌外膜囊泡的产量达到701mg/L，较原始菌株在LB培养基中培养产量，提高了约100倍，可适用于制药工业大量生产外膜囊泡，显著降低了生产成本。采用本发明方法制备的细菌外膜囊泡，具有良好的免疫增强功能，可以添加到一般疫苗中，能够显著增强免疫效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用。

背景技术

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是革兰氏阴性菌表面出芽分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构，其大小约20nm-300nm不等。这种结构包括了脂多糖(LPS)、外膜蛋白、磷脂、细菌毒素、黏附素、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分。由于外膜囊泡不能复制且含有大量的细菌抗原，具备良好的免疫原性和免疫增强作用，可以激活宿主细胞免疫系统。因此，外膜囊泡可以作为一种极具潜力的新型细菌疫苗或免疫增强剂使用。

但是，外膜囊泡是细菌对外界释放物质、交换信号分子、转移遗传物质的载体，在正常情况下其分泌量较小。如果收集外膜囊泡用于生物制品，其成本极高，从而限制了该物质的使用推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高细菌外膜囊泡产量的方法，能够显著提高细菌外膜囊泡产量。

本发明的再一目的是提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种制备细菌外膜囊泡的方法，包括培养敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株的步骤。本发明技术方案可以适用于可以分泌外膜囊泡的任何革兰氏阴性菌，本发明优选的革兰氏阴性菌不仅包括大肠杆菌属，还包括以下任何属中的物种：大肠杆菌属、志贺氏菌属、奈瑟氏球菌属、莫拉氏菌属、博德特菌属、伯疏氏螺旋体属、布鲁氏菌属、衣原体属、嗜血菌属、军团菌属、假单胞菌属、耶尔森菌属、螺杆菌属、沙门菌属、弧菌属等。

在本发明中，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌。

在本发明中，所述细菌突变株是通过Red重组技术，缺失染色体yjeE基因的。

在本发明中，将两端带有yjeE基因上下游同源臂、中间为氯霉素抗性基因cat的同源重组片段，导入大肠杆菌J5株，进行同源重组，将大肠杆菌J5株染色体上yjeE基因置换为氯霉素抗性基因，然后消除氯霉素抗性基因，得到敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株。

在本发明中，利用温度敏感型质粒pCP20的FLP位点专一性重组酶，将大肠杆菌J5株染色体上氯霉素抗性基因cat消除。

优选的技术方案中，所述敲除了yjeE基因的细菌突变株在通气状态下培养8-12h，然后收集外膜囊泡。

优选的技术方案中，所述敲除了yjeE基因的细菌突变株采用HPO培养基进行培养，所述HPO培养基含有：大豆蛋白胨5-10g/L，胰蛋白胨15-20g/L，酵母粉5-10g/L，葡萄糖2-7g/L，磷酸氢二钠0.2-0.8g/L，250mM氯化钾溶液8-12mL/L，2M氯化镁溶液4-6mL/L，胎牛血清,8-12mL/L，pH为7.0-7.8。

本发明还提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)采用本发明方法，大肠杆菌外膜囊泡的产量达到701mg/L，较原始菌株在LB培养基中培养产量(6.9mg/L)，提高了约100倍，可适用于制药工业大量生产外膜囊泡，显著降低了生产成本。