[发明专利]一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202010259281.8 | 申请日： | 2020-04-03 |
| 公开（公告）号： | CN111394378A | 公开（公告）日： | 2020-07-10 |
| 发明（设计）人： | 潘有东;宋麒;肖安;王奕;万季;刘刚;文颖 | 申请（专利权）人： | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/66 |
| 代理公司： | 北京冠和权律师事务所 11399 | 代理人： | 朱健 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市南山*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 体外 表达 mrna 质粒 载体 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种体外表达mRNA的质粒载体，包括位于待插入表达的基因尾部3’-端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述多聚腺苷脱氧核酸poly(A)的长度为60。
3.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，还包括pSP64-Poly(A)载体除30个poly(A)及Xhol和Xbal之间序列以外的其它序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的质粒载体，其特征在于，还包括启动子序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的质粒载体，其特征在于，所述启动子序列为T7。
6.根据权利要求1-5任一所述的质粒载体，其特征在于，还包括目标蛋白基因。
7.根据权利要求1-6任一所述的质粒载体，其特征在于，所述目标蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的体外表达mRNA的质粒载体的构建方法，包括以下步骤：
S1，使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体；
S2，使用XbaI和XhoI限制性内切酶，移除pNeoCura-Exp060中的长度为30bp的片段，随后连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7 RNA聚合酶识别片段、eGFP基因编码表达片段、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060-eGFP体外转录表达示例质粒。
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