[发明专利]一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用。该质粒载体包括位于待插入表达的基因尾部3’‑端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。本发明构建的体外表达mRNA的质粒载体，包括表达目标蛋白基因和60个poly(A)，表达的mRNA直接拥有poly(A)，不需要额外的加尾操作。另外，体外转录所得mRNA在转染细胞后，呈现出更强的mRNA稳定性和更高的蛋白表达能力检测。

技术领域

本发明本涉及分子生物学技术、细胞培养、免疫生物学和图像分析等技术领域。具体而言，包括通过酶切、连接等方式将60个多聚腺苷脱氧核酸片段替换已有质粒中原来的30个腺苷脱氧核酸序列，构建为一种可在细胞内表达mRNA的质粒载体pNeoCura-Exp060；随后将绿色荧光蛋白(eGFP)基因片段插入此载体中构成示例质粒，将此示例质粒转化入适当的大肠杆菌菌株、培育后提取质粒、在体外进行酶切线性化、转录得到带有对应60个多聚腺苷核酸尾部的示例mRNA；并将此示例mRNA转染细胞，最后通过检测细胞中不同时间点此mRNA含量和所表达的eGFP荧光蛋白强度定量评估此类载体所表达的mRNA稳定性和翻译表达能力。

背景技术

信使核糖核酸(mRNA)是真核生物基因表达的重要一环，在DNA-(转录)-mRNA、mRNA-(翻译)蛋白的中心法则中处于居中的重要地位。成熟mRNA由5’-帽、5’-非翻译区域(5’-UTR)、蛋白编码序列(CDS)、3’-非翻译区域(3’-UTR)、3’-多聚腺苷核酸(3’-poly(A))尾部组成。其中5’-帽和3’-poly(A)尾部对mRNA在体内或培养细胞系内的稳定性起到重要作用，进而对mRNA翻译为蛋白或多肽的效率存在影响。

目前在分子生物学领域，大量DNA质粒载体设计为可在体外转录为信使核糖核酸(mRNA，随后这些mRNA可用于生物医学研究、临床应用领域等。体外人工转录所得mRNA在一定程度上模拟了真核生物体内转录的mRNA，其5’-帽通常来自于体外转录试剂盒，而3’-poly(A)尾部则来自于DNA载体自身所包含的多聚腺苷脱氧核糖核酸序列(同样简称为3’-poly(A))模板。

天然或人工合成的mRNA的3’-poly(A)尾部在生物体或细胞内均起到保护mRNA、防止核酸外切酶降解的作用。目前学术界和工业界绝大部分使用的体外转录用载体仅包含长度为30的3’-poly(A)模板。

发明内容

一般来说对学术研究，要求在体外转录mRNA同时立即添加长poly(A)尾的需求并不多，大部分时候30个已经够用了，而如果需要更长poly(A)尾的实验，可以使用不带poly(A)的质粒模板，在转录之后使用额外的商业化加尾试剂盒添加更长的poly(A)尾。而用于工业化生产的质粒载体，时转录、加尾分两步操作在某些情况下不太现实。

本发明的目的是构建具有可提高所得mRNA的体内或细胞内稳定性和翻译表达能力的具有更长3’-poly(A)尾部模板的mRNA体外转录用载体。因此自行构建了这个能够在转录同时添加长度为60的poly(A)质粒载体且发现确实具有更长3’-poly(A)尾部的mRNA稳定性更佳、可翻译表达为蛋白或多肽的能力更强。

具体来说，以pNeoCura-Exp060为基础，本发明采用将pSP64-Poly(A)载体中原长度为30的3’-poly(A)区段替换为长度为60的类似区段来解决。本发明使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体。

本发明的第一方面在于提供一种体外表达mRNA的质粒载体，包括位于待插入表达的基因尾部3’-端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。

在本发明的一些实施方式中，所述多聚腺苷脱氧核酸poly(A)的长度为60。