[发明专利]一种改进的乳腺癌冷冻组织开放染色质检测方法

权利要求书

1.一种改进的乳腺癌冷冻组织开放染色质检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将乳腺癌冷冻组织液氮研磨成粉末，加入Lysis Buffer重悬，将重悬后的样品过40μm滤膜收集滤液离心，再加入Lysis Buffer混匀，随后分别按顺序加入不同浓度50％、29％、35％碘克沙醇溶液梯度离心，得到含细胞核的滤液；所述Lysis Buffer包含以下终浓度的各组分：5mM KCl₂，3mM MgCl₂，10mM Tris pH7.8，0.1mM EDTA，0.10％NP40，320mM蔗糖，0.02mM Cocktail蛋白酶抑制剂，1mM DTT，0.15mM Spermine；

S2.取步骤S1含细胞核的滤液，加入Dilution Buffer稀释，然后对滤液中的细胞核进行计数，挑取50,000细胞核，离心去上清，向沉淀中加入转座体系，进行转座反应；然后对已转座的DNA进行纯化，再进行PCR扩增，最后将PCR产物纯化后进行测序；所述DilutionBuffer包含以下终浓度的各组分：10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl₂，0.10％Tween 20。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述乳腺癌冷冻组织与LysisBuffer的质量体积比为10～20mg：1～2mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述梯度离心溶液为先加入50％碘克沙醇溶液，重悬混匀，使终浓度为25％，再将29％碘克沙醇溶液加至25％的溶液层之下，最后将35％碘克沙醇溶液加至29％的溶液层之下，离心。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述含细胞核的滤液与DilutionBuffer的体积比为2：5～6。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述转座体系为25μL TD Buffer，2.5μL DDW，2.5μL TDE1，16.5μL PBS，0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述转座反应为1000rpm，37℃，30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述对已转座的DNA进行纯化为用VAHTS DNA Clean beads进行纯化：向已转座的DNA中加入VAHTS DNA Clean beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR产物纯化为用VAHTSDNAClean beads进行纯化：向PCR反应产物中加入终浓度为0.5×的VAHTSDNA Clean beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，将上清液转到新管中，加入终浓度为2.0×的VAHTSDNA Clean beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脱。

9.权利要求1～8任一项所述方法在乳腺癌冷冻组织开放染色质检测中的应用。

10.一种用于乳腺癌冷冻组织开放染色质检测的产品，其特征在于，包含权利要求1中所述的Lysis Buffer，不同浓度碘克沙醇溶液及Dilution Buffer。