[发明专利]一种改进的乳腺癌冷冻组织开放染色质检测方法

说明书

本发明公开了一种改进的乳腺癌冷冻组织样品的开放染色质检测方法，把乳腺癌冷冻组织液氮研磨成粉末后，加入Lysis Buffer重悬，将重悬后的样品过40μm滤膜收集滤液离心，再加入Lysis Buffer混匀，随后加入不同浓度的碘克沙醇溶液梯度离心，得到含细胞核的滤液；然后加入Dilution Buffer稀释，对滤液中的细胞核进行计数，挑取50,000细胞核，离心并去除上清，向沉淀中加入转座体系，进行转座反应；然后对已转座的DNA进行纯化，再进行PCR扩增，最后将PCR产物纯化后测序。所述方法能有效对临床乳腺癌冷冻组织进行染色质结构检测，该方法可结合患者的临床数据，从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种改进的乳腺癌冷冻组织开放染色质检测方法。

背景技术

在人类细胞细胞中，DNA与多种蛋白结合形成具有多层结构的染色质。然而，只有1％的染色质是活跃的，被称为活跃染色质(开放染色质)。这些活跃染色质((如启动子，增强子)的打开和关闭，以及它们在细胞核中的位置与基因的表达调控和细胞的生物学行为有密切关系。

一直以来，研究者利用DNase I酶切和高通量测序方法(DNase-Seq)揭示活跃染色质在基因组中的线性位置。但是这种方法需要10⁷级别数量以上的细胞以及大量的时间投入，限制了其在临床活检中的应用。2013年底斯坦福大学Greenleaf教授和Howard Chang报道的ATAC-seq(Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技术的出现突破这一限制，为研究染色质的可接近性提供了全新的手段(ATAC-seq通过Tn5转座酶将测序的adapters插入到基因组上的“可接近”区域来标记调控的区域，仅需500～50000个细胞就能获得高质量的染色质开放结构图谱并随着测序深度的加深(达200millionsreads)，甚至可以直接看到转录因子的结合位点(有转录因子结合的地方不被Tn5酶切割，形成印迹(footprint)，大大简化了实验流程及样本损耗。2017年7月12日，ATAC-seq技术发明者之一Howard Chang通过追踪患者在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)抗癌药物治疗过程中各个时间点的表观遗传状态，首次在时间尺度上深入研究表观遗传基因组和关键性转录因子对患者药物敏感性的动态调控机制，并准确预测患者对HDACi抗癌药物的敏感性，为新的靶向治疗方案提供依据，也为研究其他疾病的精准医疗的表观遗传调控机制建立模板。另外，通过ATAC-seq数据对正常、混合、宿主、肿瘤细胞的DNA拷贝数进行分析，利用人类染色体图显示人类基因组DNA的拷贝数在各细胞类型中的差异，Howard Chang证实了在混合和肿瘤细胞中多个已被报道的遗传变异，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，并发现这些变异并没有发生在正常人或者患者的宿主细胞中。有趣的是，HowardChang发现遗传层面的DNA拷贝数差异并不能反映患者对药物的敏感性，相反，表观遗传层面的转录因子调控机制却可以准确的预测患者对药物的应答情况，再一次说明对患者表观遗传基因组研究的重要性，也提示了当前精准医疗研究中常规使用的基因测序的局限性。同时，这些鉴定出的转录因子可以很好的区分正常人和处于不同癌症阶段的病人，基于这一点，可以将正常人与癌症病人、不同阶段癌症病人特异的转录因子核酸序列设计成为基因芯片上的靶核苷酸探针来检测病人是否患有癌症或位于癌症的哪个阶段，这些新的特异探针也大大拓展了现有的一些经典的检测探针，使得基因芯片的结果更具准确性。

遗憾的是，经典的ATAC-seq技术只能在新鲜细胞中进行Tn5的转座实验，否则文库的质量极差。因此严重限制了ATAC-seq在临床样本检测中的应用。专利CN 108300774A公开了一种针对冰冻组织的ATAC-seq方法，但是将所述方法用于乳腺癌冷冻组织的ATAC-seq研究时，构建的文库质量依然较差。因此，需要针对乳腺癌提供一种改进的乳腺癌冷冻组织开放染色质检测方法。

发明内容