[发明专利]一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，前增菌培养

在无菌条件下称取25g鱼粉样品，加入装有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的培养瓶中，混匀，在36℃±1℃的培养箱中培养18h±2h；

S2，采用拜发沙门氏菌ELISA试剂盒法对步骤S1培养后的样品进行检测：

S21，准备微孔板

将对照液和样品检测所需的微量反应条固定在微孔架板内；

S22，加样

在选定的微孔中分别加入100μL上述培养后的前增菌液及阴性和阳性对照液，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.2～1h；

S23，第一次洗板

弃掉反应微孔内的液体，采用200～400μL洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；

S24，增菌培养

于各反应微孔中加入250μL预热好的沙门氏菌板内增菌培养基，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育3～5h；

S25，第二次洗板

弃掉反应孔内的液体，采用300μL洗涤液对各微孔进行清洗，清洗3～5次；

S26，加入酶连接物

在反应孔中加100μL的酶连接物，盖上反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5～1h；

S27，第三次洗板

弃掉孔中液体，采用200～400μL洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；

S28，加入底物，终止反应

在清洗后的反应微孔中加入100μL底物，在室温条件下暗处孵育0.25～1h，再向每个微孔中加入100μL反应终止液，终止反应；

S29，测定样品OD值

采用酶标仪在450nm条件下使用微孔板测定OD值，620nm作为对照参考波长，确定OD值的判定线，根据OD值大小来判断鱼粉样品中是否含有沙门氏菌；结果为阴性的样品为未检测到沙门氏菌；结果为阳性的样品可能含有沙门氏菌，采用国标法继续往下进行检测；

S3，选择性增菌培养

对于采用步骤S2中ELISA试剂盒(Salmonella)检测结果为阳性的样品，采用国标法继续往下进行检测，混匀这部分样品经过步骤S1培养的前增菌液后，取1mL前增菌液接种于装有10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液的容器中，在36℃±1℃培养18h～24h，另取1mL前增菌液接种于装有10mL氯化镁孔雀绿增菌液的容器中，在42℃±1℃条件下培养18h～24h；

S4，分离培养

采用接种环取1环步骤S3的选择性增菌培养基，划线接种在亚硫酸铋琼脂平板上，于36℃±1℃培养24h～48h；用接种环取1环选择性增菌培养基，划线接种在胆硫乳琼脂平板上，于36℃±1℃培养18h～24h，观察判断菌落是否为典型菌落；

其中，BS琼脂平板的沙门氏菌菌落特征为：黑色带光泽、棕色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色菌落，周围培养基不变；DHL琼脂板的沙门氏菌菌落特征为：无色半透明或粉红色，菌落中心黑色；

S5，生化鉴定试验

挑取步骤S4中分离培养中的典型菌落，用新型微生物微量生化鉴定管鉴定是否属于沙门氏菌属，生化鉴定试验包括，三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验，白做靛基质试验，尿素酶试验，氰化钾(KCN)试验，甘露醇和山梨醇试验，β-半乳糖苷酶试验，综合上述生化鉴定试验的结果来判断样品中检出或未检出沙门氏菌。

2.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用振荡器震荡混匀。

3.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S22中，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5h。

4.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，述步骤S23中，采用300μL洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗7次。

5.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S29中，所述OD值的判定线为1.000，OD值小于1.000的样品为阴性；OD值大于等于1.000，结果为疑似阳性，疑似阳性的样品，需要采用国标法继续往下进行检测。