[发明专利]一种新型冠状病毒RNA核酸检测质控品及其制备方法

权利要求书

1.一种新型冠状病毒RNA核酸检测质控品，其特征在于，用于全方位监测COVID-19核酸检测过程。

2.一种新型冠状病毒RNA核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)目的片段的PCR扩增

根据COVID-19ORF1ab及N两个基因的序列，设计如下引物：

ORF1ab-F：5’-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3’，

ORF1ab-R：5’-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3’；

N-F：5’-CACATTGGCACCCGCAATC-3’，

N-R，5’-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’；

依据MS2噬菌体基因组11-1770碱基序列设计如下引物：

F1：5’-CCTTTCGGGGTCCTCA-3’，

R1：5’-TTAAGCTTCTTCGACATGGGTAATCCT-3’；

F2：5’-ACAATCCGTATGGCCAACTG-3’，

R2：5’-CGGGAGGAAGATCAATACATAAAG-3’；

F3：5’-TCAAGCn'AGATCACTCCCCTGTG-3’，

R3：5’-TCTTCGAACTCGCAAGCACCCTAT-3’；

扩增体系为：2×PCRBuffer10μl，正向、反向引物各1μl，人工合成模板2μl，ddH₂O 6μl，构成20μl反应体系；

(2)PCR产物的酶切与回收

使用FastDiagest限制性内切酶对步骤(1)的扩增产物进行酶切消化，之后对消化产物进行琼脂糖电泳，120V、30min，对特定片段长度区域的琼脂糖胶进行切割，利用琼脂糖DNA回收试剂盒进行扩则目的片段回收，后续应用Sanger测序对回收产物进行验证；

(3)目的片段整合与转化

首先将编码MS2噬菌体包膜蛋白与成熟酶蛋白的基因利用特定连接酶连接至pET28b质粒中NCO-I、Hind-III两个多克隆位点之间，构成MS2包膜蛋白表达质粒；之后将COVID-19的ORF1ab及N两个基因的序列连接至Hind-IV位点后，构建pINCCL-ORF1ab-N表达质粒；

选择JM109菌株作为感受态受体菌株，使用前述的pINCCL-ORF1ab-N表达质粒转化此感受态菌株，接种到含有青霉素的平板；

(4)耐RNase噬菌体颗粒的表达与验证

采用BL21-DE3作为宿主菌，在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养，经过IPTG诱导表达后对培养菌体进行超声裂解，获得噬菌体样颗粒，具有耐RNase潜质；后续使用RNaseA与DNaseI对此样本进行消化处理，验证其对核酸酶的抵抗作用；

(5)新型耐RNase COVID-19质控品的生产与验证

将前述制备所得耐RNase的COVID-19质控品用PH7.2的PBS稀释并用0.22μm一次性滤器过滤除菌得到耐RNase COVID-19质控品原液，置4℃冰箱备用；将上述已纯化好的耐RNaseCOVID-19质控品原液用阴性血浆倍比稀释，稀释比例为1:10、1:100、1:1000；

使用数字PCR方式对前述梯度稀释产物进行绝对定量，依据绝对定量结果标注对应样本的拷贝数，之后依据此拷贝数对RNase COVID-19质控品原液进行赋值，并依据需要进行分装与低温冷冻保存。

3.一种利用权利要求2的制备方法制备的新型冠状病毒RNA核酸检测质控品的稳定性评估方法，其特征在于，包括如下实验步骤：将分装好的质控品分别放置于室温、37℃、与2-8℃冷藏环境中，从第0周开始，每周抽取2支样本，每支样本从核酸提取开始平行做双份，使用ddPCR对样本进行检测。

4.一种利用权利要求2的制备方法制备的新型冠状病毒RNA核酸检测质控品的线性分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、将质控品设置为10⁷、10⁶、10⁵及10⁴Copies/ml，获得一系列梯度稀释产品；

b、应用COVID-19检测试剂盒对步骤a中的样本进行检测，分析质控品的线性。