[发明专利]一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品及其制备方法

权利要求书

1.一种ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，为包括去激素血清和ApoA-II、ApoC-II两种蛋白阳性物质的冻干品。

2.根据权利要求1所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，还包括三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000和ProClin 950。

3.根据权利要求2所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度≥99.9％。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备人ApoA-II、ApoC-II基因克隆与表达载体；

(2)利用80L发酵罐大规模发酵表达rhApoA-II、rhApoC-II；

(3)rhApoA-II、rhApoC-II的纯化；

(4)ApoA-II、ApoC-II蛋白质控品的的配制、赋值与分装。

5.根据权利要求4所述的ApoA-II、ApoC-II检测混合质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：

(1-1)Trizol方法从人肝组织中提取总RNA，将新鲜分离的人肝组织切成100mg的大小，立即放入液氮；

取出冰冻的组织300mg进行研磨，将碾碎组织转移至50ml离心管中，加入5ml Trizol，室温使用匀浆器高速匀浆15-30sec，加入1.0ml氯仿，充分震荡摇匀，室温下放置5min，4℃离心15min；

将上层水相移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡摇匀，沉淀10min，4℃离心15min弃上清，加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，4℃离心5min，将总RNA沉淀溶于50ul DEPC处理过的水中，-80℃保存备用；

(1-2)将抽提完的RNA取1ug，1ul OligodT，70℃变性10min，冰浴1min，然后加入下列反应液体：

于PCR仪上42℃反应60min，95℃灭活5min，合成cDNA用于下列反应：

根据Genebank中已发表的人ApoA-II、ApoC-II基因设计引物，

poA-II-F：ATGAAGCTGCTCCAGCAACTGT；

ApoA-II-R：TTATCACTGGGTGGCAGGCTGT；

ApoC-II-F：TCCAGCAGCAAGATTCAGAGTGCC；

ApoC-II-R：TGGGATGTCACCCTTCAGGGTC；

反应体系为：

按照下列PCR扩增程序扩增：

①94℃2min；

②94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，30个循环；

③72℃10min；

将PCR产物进行1％琼脂糖电泳，紫外灯下切下目的片段，并使用DNA回收试剂盒进行回收；

(1-3)回收后的ApoA-II、ApoC-II基因片段与T载体16℃连接过夜，连接反应体系如下：

最终获得重组克隆质粒pMD18-T-ApoA-II、pMD18-T-ApoC-II；

(1-4)XL₁-Blue感受态细胞的制备

(1-4-1)挑取单个菌落接种于5ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取lml菌液接种于含有100ml LB培养基的1L培养瓶中，37℃、250r/min震荡培养3h；

(1-4-2)4℃离心10min收集细胞；

(1-4-3)倒出培养液，将管倒置1min以使培养液流尽；

(1-4-4)用60ml预冷过的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂重悬细胞；

(1-4-5)4℃离心10min，回收细胞；

(1-4-6)加入140ul DMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min；

(1-4-7)再加入140ul DMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min，每管100ul无菌分装，-80℃冻存；

(1-5)重组质粒的转化

(1-5-1)取一管冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀；

(1-5-2)冰浴30min；

(1-5-3)将反应管放入42℃水浴中，热激90s；

(1-5-4)向管中加入800ul预热的SOC培养基，将管转移到摇床上震荡培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

(1-5-5)取200ul已转化的感受态细胞涂布于含Amp的LB平板培养基上，室温放置直至液体被吸收，37℃倒置培养12h-16h；

(1-6)rhApoA-I毕赤酵母分泌型表达载体的构建

(1-6-1)根据GenBank已发表的hApoA-IDNA序列，设计引物，扩增5’端引入Xhol限制性内切酶位点和Kex2蛋白酶识别序列编码基因，3’端引入Xbal限制性内切酶位点的ApoA-II、ApoC-II编码序列；

上游引物：31bp

5’-AAACTCGAGAAGAGAGATGAACCCCCCCAGA-3’；

下游引物：32bp

5’-GCGTCTAGATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3’；

(1-6-2)PCR反应

按下述比例在0.2ml EP管中建立PCR反应体系：

在PCR仪上进行循环扩增，扩增程序为：

①94℃4min；

②94℃30s，61℃30s，72℃1min，30个循环；

③72℃10min；

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因；

(1-7)pPICZa-hApoA-II、pPICZa-hApoC-II分泌型表达载体构建

构建表达载体的PCR上、下游引物中分别设计有Xhol和Xbal酶切位点，供基因重组到载体pPICZa相应的内切酶部位；

用Xhol和Xbal消化目的基因hApoA-I和载体pPICZa，回收酶切产物，16℃连接过夜；

(1-8)酵母感受态的制备

(1-8-1)取毕赤酵母X-33菌种，于不含抗生素的YPD阴性培养板划线培养，30℃、2～3d；待菌落长至2～3mm，挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，225r/min、30℃震荡培养24h；

(1-8-2)取其中200ul菌液接种于200mlYPD培养基中，250r/min、30℃震荡培养过夜；

(1-8-3)4℃离心5min，收集细胞；

(1-8-4)倒出培养液，将管倒置1min使培养液流干；

(1-8-5)用200ul预冷过的超纯水重悬细胞，4℃离心，弃上清；

(1-8-6)用20ml预冷过的1mol/L D-山梨醇重悬细胞，4℃离心5min，弃上清；

(1-8-7)用300ul预冷过的1mol/L D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，置于冰上，当天使用；

(1-9)转化

(1-9-1)取80ul酵母感受态细胞，与10～15ul上述线性化的重组质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min；

(1-9-2)擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数电转化；

(1-9-3)立即加入1ml冰浴的山梨醇，将混合物转到1.5ml EP管中；

(1-9-4)30℃静置孵育lh～2h；

(1-9-5)取100～200ul转化后的菌液涂布于含Zeocin的YPD平板上，30℃静置培养2d～3d，观察转化子的生长；

(1-10)阳性菌株的筛选

(1-10-1)从转化菌的YPD培养板上挑取20个克隆分别接种于10ml BMGY培养基中，30℃震荡培养24h；

(1-10-2)每个克隆收集发酵液1ml，离心5min，弃上清；

(1-10-3)向沉淀中加入500ulPBS缓冲液，悬浮沉淀；

(1-10-4)离心3min，弃上清；

(1-10-5)用100ulbufferTE溶解沉淀，沸水浴10min；

(1-10-6)-80℃冷冻30min；

(1-10-7)再次沸水浴10min后，离心5min；

(1-10-8)收集上清，每个克隆取10ul上清作模板，建立PCR反应体系，产物用于酵母基因组鉴定；

PCR体系为：

①94℃2min；

②94℃30s，61℃30s，72℃1min，30个循环；

③72℃10min；

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段；

(1-11)转化子的诱导表达

(1-11-1)取上述PCR鉴定结果阳性的克隆菌株，分别接种于10ml BMGY培养基中，30℃震荡培养24h，并收集细胞；

(1-11-2)等体积BMMY重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达，在诱导过程中，每24h补充甲醇至终浓度0.5％，同时补充DEPC水，使发酵液总体积保持不变；

(1-11-3)连续诱导培养7d，每24h取1ml发酵液，离心，上清用于rhApoA-II、rhApoC-II的SDS-PAGE分析。