[发明专利]一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30 min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；

B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；

C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD₆₀₀，当所述种子液的OD₆₀₀达到1.0后停止发酵；

D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在30-37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；

E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70-75%。

2.先采用波长为254 nm、功率为20-50 W的紫外灯，辐照10-30 min，然后使用⁶⁰Co源进行γ辐照，辐照剂量为50-500 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照10-30min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵36-48 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，罐中搅拌转速为50-100 RPM，培养温度为30-37℃；发酵结束后，将所的第二条斑紫菜发酵液在8-12℃环境下静置15-60 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；

F、SOD的分离提纯：将步骤F所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器和蛋白液相系统，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m²h；所述蛋白液相系统采用50 kDa的聚醚砜（PES）膜；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。

3.根据权利要求1所述的条斑紫菜发酵制备耐高温超氧化歧化酶的方法，其特征在于：所述耐高温超氧化歧化酶的活性大于5700 U/mg，纯度大于96%，所述百分比为质量百分比。

4.权利要求1所述耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用。

5.权利要求3所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的应用，添加量为质量百分比0.05%-5%。

6.权利要求5所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的应用，添加量为质量百分比3%。