[发明专利]一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用，其特征在于：采用以下步骤：A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗、粉碎、过网，制得得条斑紫菜浆料；B、制备NB液体培养基；C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，得枯草芽孢杆菌种子液；D、一次发酵：发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；E、二次发酵：得第三条斑紫菜发酵液；F、分离提纯：将步骤F所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器和蛋白液相系统，分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。本发明制备的耐高温超氧化歧化酶80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，具有耐高温，稳定性好的优点，添加到化妆品中具有抗衰老作用。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员之一，广泛分布在微生物、植物和动物体内。它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。由于人的皮肤直接与氧气接触，活性氧类自由基堆积或清除产生障碍都会引起细胞损伤以及色素沉着，导致皮肤衰老和损伤。通过补充外源SOD，可起到抗氧化、祛色斑的作用，有利于延缓皮肤衰老。因此，SOD可广泛应用于抗衰老护肤类产品中，应用前景广阔。但目前，由于商品化的SOD热稳定性差，易失活，极大限制其功能的正常发挥，导致市场需求受到影响。此外，市场上流通的SOD大多来源于动物血液，容易受到污染，产生细菌内毒素，从而引发热源性问题，且生产量小，成本高。而微生物发酵则是一种反应温和可控、容易放大、安全环保的生物反应过程。通过选择合适的微生物，能在发酵过程中将海藻细胞破壁，充分释放出细胞内的生物活性物质。

条斑紫菜（P. yezoensis Ueda）是一种具有很高科学研究价值的经济海藻，具有独特的生物学特性。条斑紫菜为潮间带大型藻类，生长在潮间带的岩石上。由于其生存环境的特殊性，随着潮汐作用，周期性的经历海水和空气两种截然相反环境条件的变化，面临失水、高渗、强光和营养限制等逆境胁迫，体内形成了与环境相适应的独特代谢途径和抗氧化酶系。SOD作为抗氧化酶系统成员之一，在抵御外界逆境胁迫中有相当重要的作用。该酶活性的高低与生物抗逆性和抗辐射能力有关。然而，目前为止海藻液的提取多是基于酸、碱法，该方法不仅提取率低，更重要的是酸碱的使用会带来一系列污废处理的问题，提高成本的同时对环境污染破坏严重。此外，考虑到基因工程成本高、操作复杂，以及其安全性有待考究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种利用条斑紫菜发酵制备耐高温超氧化歧化酶的方法，以及该耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用。本发明具有发酵工艺简单，无需进行细胞破壁，产量高，且制备得到的SOD纯度高、耐高温、活性高，同时还具有保湿、抗皱、皮肤修复等多重护肤功效。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30 min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；

B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；