[发明专利]可视化检测肿瘤外泌体的纳米杂化物探针的制备方法

权利要求书

1.可视化检测肿瘤外泌体的纳米杂化物探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)铜离子配位黑磷量子点Cu-BPQDs的制备：将25mg黑磷晶体加入30mL氮甲基吡咯烷酮中，加入1mol/L硝酸铜水溶液5mL，加入溶解了5mg巯基丙酸的水溶液5mL，磁力搅拌形成均质混合液；将混合液用超声波细胞粉碎仪处理2h，再用超声波清洗器水浴处理6h；将处理后的分散液转入微型磁力高压反应釜中，在N₂保护下加热至120℃，连续搅拌反应12h；反应产物冷却至室温，在5000rpm转速下离心10min，取上层清液在14000rpm转速下离心15min；离心后的沉淀物用乙醇和二次蒸馏水冲洗3次，真空干燥得到羧基功能化Cu-BPQDs；

(2)Cy5内包封二氧化硅纳米球Cy5-SiO₂的制备：将聚乙二醇氨基PEG-NH₂功能化Cy5溶于无水乙醇，加入(3-氨丙基)三乙氧基硅烷APTS，搅拌均匀，放置避光处；加入氨水与乙醇，搅拌均匀，加入正硅酸乙酯TEOS继续搅拌，再加入TEOS进行反应；反应产物经离心、乙醇洗涤和干燥后制得Cy5内包封SiO₂纳米球；将其分散在APTS与醋酸的混合液中，在室温下执行搅拌反应，产物经离心、洗涤和干燥，得到表面氨基功能化Cy5-SiO₂纳米球；

(3)Cy5-SiO₂/Cu-BPQDs/mSiO₂复合物的制备：将N-羟基硫代琥珀酸亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC盐酸盐分散在磷酸盐水PBS缓冲液中，加入氨基功能化Cy5-SiO₂纳米球，搅拌均匀，放置避光处；磁力搅拌下将羧基功能化Cu-BPQDs水分散液加入混合液中，搅拌反应；产物经离心、洗涤和干燥后制得Cy5-SiO₂/Cu-BPQDs杂化物；将此杂化物溶于无水乙醇，加入十二烷基三甲基溴化铵DTAB和APTS，搅拌反应，放置避光处；加入氨水与乙醇后搅拌均匀，加入TEOS搅拌，再加入TEOS继续反应；加入NH₄NO₃洗脱模板DTAB，产物经离心、乙醇洗涤和干燥后制得氨基功能化复合物，简称为Complex；

(4)纳米杂化物载体探针Complex-5Fu-DNA1/DNA2的制备：向磷酸盐水PBS缓冲液中加入偶联剂NHS和EDC盐酸盐，加入氨基功能化Complex，搅拌反应，添加一端为-COOH另一端为-SH的单链DNA1即HS-DNA1-COOH，在室温下搅拌反应；反应产物经透析、除溶剂、离心、洗涤和干燥制得杂化物Complex-DNA1；采用水浴孵化，电子受体分子5-氟尿嘧啶5Fu进入mSiO₂孔道内，完成电子受体分子的负载，形成Complex-5Fu-DNA1；添加DNA1的互补链DNA2，由于两条DNA单链的碱基互补配对形成双螺旋结构，将电子受体分子封装在mSiO₂孔道内，制得Complex-5Fu-DNA1/DNA2；

(5)将此纳米杂化物载体探针分散于磷酸盐水PBS缓冲液中，加入含有肿瘤外泌体的水分散液或生物流体样品，磁力搅拌均匀；将此载体探针与含有外泌体的样品形成的混合分散液，用滴管转移至玻璃比色皿中，或滴涂在聚酰亚胺柔性薄膜上；采用365nm波长紫外光激发照射，用智能手机拍摄比色皿中或柔性薄膜上混合分散液的FL颜色；建立混合分散液的FL颜色类型与混合分散液中肿瘤外泌体浓度的关联，构建样品的FL颜色类型变化与样品中肿瘤外泌体浓度的对应关系；肿瘤外泌体可视化检测的浓度范围为2×10¹～5×10⁶particles mL^–1，检测限为20～100particles mL^–1。