[发明专利]水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒

说明书

本发明公开了水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒，利用同位素内标，设计配制提取剂A、提取剂B用于样品的提取和净化，再将提取液经过滤器直接过滤至进样瓶中即可上机检测，可极为显著地减少样品前处理步骤，减少多步操作带来的药物损失，使检测结果更为准确，使操作更为简单，大幅度提高工作效率，实现大批量样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的快速定量分析。

技术领域

本发明属于水产品中孔雀石绿残留物检测技术领域，具体涉及水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green)又名碱性绿，是一种三苯甲烷类化工染料，曾被用作驱虫剂和杀菌剂治疗水产品水霉病、腮霉病和小瓜虫病等，以及用于环境消毒、池塘暂养和活鱼运输等过程。孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green)在生物体内消除缓慢、残留时间长，且具有致癌、致畸和致突变等毒副作用，破坏生物体生殖及免疫系统，尤其是隐色孔雀石绿，其毒性更大。因此，包括欧美、中国在内的许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。虽然国内违规使用孔雀石绿的现象已得到较好控制，但由于其价格低廉和效果显著，仍有少数渔民在非法使用，在水产行业中，孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留限量标准为1μg/kg，二者总量超过1μg/kg即视为药残超标的问题水产品。

目前，检测孔雀石绿及隐色孔雀石绿的方法主要有免疫分析法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法和液相色谱-质谱法、薄层色谱法、电化学检测法、胶体金快速检测试剂板法等，国内测定孔雀石绿及隐色孔雀石绿的标准方法有GB/T19857-2005、GB/T20361-2006和SN/T1768-2006等。免疫分析法需要先通过化学方法设计合成半抗原，再进一步与载体蛋白结合获得具有免疫性的完全抗原，用于真实样品的检测存在假阳性的问题，阳性样品还需进一步确证；气相色谱-质谱法仅可以测定具有挥发性质的隐色孔雀石绿；表面增强拉曼光谱法适用于定性及半定量的快速测定；薄层色谱法不能做到孔雀石绿和隐色孔雀石绿同时检测，且灵敏度较低，一般不用作残留检测，仅作定性分析；电化学检测法受复杂基质干扰等因素影响，尚没有成功应用到动物样品的检测中；胶体金快速检测试剂板法是一种现场快速筛查法。GB/T19857-2005中的液相色谱法需要柱后衍生，紫外-可见光检测器测定，检出限为2μg/kg；GB/T20361-2006中的液相色谱法将孔雀石绿转变为隐色孔雀石绿，荧光法测定，只能测隐色孔雀石绿，可见，液相色谱法尚不能满足日常监管工作的残留限量标准要求。

液相色谱-质谱法灵敏度及准确度高，检出限可达0.5μg/kg，常被用作水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的确证方法。申请号为201910746154.8的中国专利公开了一种水产品中孔雀石绿的残留检测方法，该发明采用自制的固相萃取柱(主要填料为壳聚糖、硅藻土、活性炭和碳纳米管)，对振荡提取后的样品溶液进行吸附净化，再将待测物洗脱，收集洗脱液氮吹浓缩，用乙腈和乙酸铵溶解残渣，过滤膜，制得上机的待测液，供液相色谱-质谱仪检测。申请号为201810060294.5的中国专利公开了一种检测水产品中孔雀石绿、结晶紫(crystal violet)及其代谢产物的前处理方法，该发明依然采用传统的前处理步骤，包括待检样品均质、离心、固相萃取柱的活化、上样、洗脱、过滤膜等步骤，制得上机的待测液，前处理繁琐而耗时。在目前众多液相色谱-质谱法中，普遍存在前处理操作过程耗时较长的缺点。

发明内容

针对上述不足，本发明公开了一种水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒，显著地减少样品前处理步骤，使操作更为简单，大幅度提高工作效率，实现大批量样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的快速定量分析。

本发明是采用如下技术方案实现的：

水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法，其包括以下步骤：