[发明专利]一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法

权利要求书

1.一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）分离纯化CD4⁺和CD8⁺ T细胞；

2）制备高浓度钾离子培养基；所述高浓度钾离子培养基中氯化钾摩尔浓度为：45.33mM；氯化钠的摩尔浓度为：63.45 mM；

3）T细胞的培养与改造：将50万个步骤1）获得的所述CD4⁺ T细胞与50万个步骤1）获得的所述CD8⁺ T细胞混合，用0.5 ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5% CO₂培养箱，培养24小时；

4）慢病毒感染；

5）分离改造后的T细胞；

6）改造后的所述T细胞扩增；

7）培养9天后，当所述T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率；

所述步骤1）中所述CD4⁺ T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到，所述CD8⁺ T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到；

所述步骤3）的所述磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞扩增磁珠，加入5倍体积所述高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附所述CD3/CD28细胞扩增磁珠，除去液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b）三次后用0.5 ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到所述磁珠悬液；

所述步骤5）具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的所述T细胞与所述磁珠分离，使用磁铁除去所述磁珠；

所述步骤6）的具体步骤为：将所述T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万所述T细胞每毫升添加新的所述高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万所述T细胞每毫升添加新的所述高浓度钾离子培养基。

2.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤1）中，具体步骤为：先进行细胞计数，然后分离纯化CD4⁺和CD8⁺ T细胞，其中，可使用细胞计数板或细胞计数仪进行所述细胞计数。

3.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，步骤4）的具体为：加入装载CAR T基因的慢病毒并添加所述高浓度钾离子培养基至孔内液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的所述高浓度钾离子培养基。

4.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤7）中，所述杀伤试验为荧光素酶靶细胞杀伤试验。