[发明专利]一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法

说明书

本发明公开了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，具体步骤包括：1)CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞与CD3/CD28细胞扩增磁珠在高浓度钾离子培养基中培养；2)用装载CAR T基因的慢病毒进行感染；3)将细胞与CD3/CD28细胞扩增磁珠分离；4)在高浓度钾离子培养基中扩增细胞；5)检测体外杀伤效率；本发明在T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的过程中引入一定浓度的钾离子，可提高CAR T细胞的激活水平以及体外杀伤能力。本发明具有操作简单，重复性好，成本低廉的优点，具有很高的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，尤其涉及一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗近年来在肿瘤治疗领域取得了诸多重要进展，包括过继性免疫治疗，非特异性免疫调节治疗，免疫检查点阻断治疗和单克隆抗体治疗等。其中，嵌合抗原受体T细胞治疗(Chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR T cell therapy)是目前最重要的肿瘤免疫治疗方法之一，其主要治疗流程是通过慢病毒等方式改造病人外周血中分离的T细胞，得到特异性CAR T细胞实现对肿瘤的特异性治疗。

T细胞需要两个信号来激活，一般通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)递呈的抗原多肽以激活CD3信号通路获得第一信号，并同时通过T细胞表面的共刺激分子和APC或靶细胞上的配体结合以获得第二信号。两者共同作用激发下游级联反应使得T细胞激活和增殖并进行细胞杀伤等。鉴于第一信号会受到组织相容性复合体(MHC)限制的问题，为了摆脱这一限制，CAR T细胞主要通过表达嵌合抗原受体分子，直接与抗原受体结合并激活胞内信号以激活T细胞。在进行CAR T治疗时，需要从病人外周血中分离T细胞，并对T细胞进行体外培养以及改造。但如何改进其体外培养条件，以增加T细胞后续杀伤能力至关重要，将直接影响CAR T治疗效果而具有重要实际应用价值。

在最近的研究中发现，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞快速分裂并导致产生细胞凋亡与坏死的密集区域。在细胞坏死后，胞内离子释放造成肿瘤间质液(TIF)中局部离子失衡，钾离子高于血清中浓度并且抑制T细胞的效应子功能。进一步的研究显示，胞外高浓度的钾离子可通过触发T细胞饥饿反应，可限制T细胞效应子功能并且维持其干性。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，通过优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CAR T细胞的体外培养和改造，以加强CAR T细胞的激活程度以及体外杀伤能力。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何加强CAR T细胞的激活程度以及体外杀伤能力。

为实现上述目的，本发明提供了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离纯化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

2)制备高浓度钾离子培养基；

3)T细胞的培养与改造：将50万个步骤1)获得的CD4⁺T细胞与50万个步骤1)获得的CD8⁺T细胞混合，用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱，培养24小时；

4)慢病毒感染；

5)分离改造后的T细胞；

6)改造后的T细胞扩增；

7)培养9天后，当T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率。