[发明专利]检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜Millipore 135；所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A、金标垫及样品垫的预处理：

分别将用于制备金标垫及样品垫的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964浸泡在pH为7.4，0.015mol/L的PBS预处理液中，3h后取出，37℃烘干，4℃干燥保存，其中所述PBS预处理液含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN₃；

B、金标垫的制备：

(1)胶体金的制备：将氯金酸水溶液加入超纯水中，加热，再加入柠檬酸三钠水溶液搅拌，继续煮沸，冷却，定容，即获得胶体金溶液，避光保存备用；

(2)金标重组R7蛋白的制备：用K₂CO₃溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得金标重组R7蛋白溶液；

(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液稀释至稀释度为1:3，再喷涂在经过步骤A处理的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964上，烘干，得到金标垫，密封保存；

C、反应垫的制备：

(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成2.5mg/mL的检测线溶液和0.8mg/mL的质控线溶液，将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜Millipore 135上形成检测线，将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜Millipore 135上形成质控线，得到反应垫，密封干燥保存，备用；

D、试纸条的制备：

(1)将底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫组合，在底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠，即得所述检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条。

2.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述重组R7蛋白由如下方法制备而成：

(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；

(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coli TOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；

(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；

(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述氯金酸水溶液与超纯水的比值为1:(100-105)。

4.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述氯金酸水溶液的质量百分数为0.5-2％，所述柠檬酸三钠水溶液的质量百分数为0.5-2％，所述BSA溶液的质量百分数为5-10％。

5.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述金标复溶液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖，1％海藻糖，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN₃；所述金标复溶液和原胶体金溶液的体积比为1:(18-20)；所述稀释所用的溶液为金标复溶液。