[发明专利]一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）一株食品级宿主嗜热链球菌CH3080的构建方法，包括如下步骤：

①提取嗜热链球菌JIM8232（Streptococcus thermophilus JIM8232）的基因组DNA；

②以步骤①的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂；

③使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤②中制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；

④将步骤③得到的重组质粒转化嗜热链球菌JIM8232中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出2000bp目的产物的菌体即为β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株；命名为嗜热链球菌CH3080；

（2）将食品级表达载体pST4040转化入嗜热链球菌CH3080，所述食品级表达载体pST4040的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述一种食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂PCR扩增体系如下：

Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物N-up-F 2 µL，引物N-up-R 2 µL，基因组DNA 1µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；

所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因下游同源臂PCR扩增体系如下：

Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物N-down-F 2 µL，引物N-down-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；

所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：

Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物N-up-F 2 µL，引物N-down-R 2 µL，上游同源臂 1 µL，下游同源臂 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水12 µL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。

3.如权利要求1所述一种食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤③验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250 µg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250 µg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。